LunaScript® 一步法多重 RT-PCR 试剂盒–NEB酶试剂

产品资料 – DNA聚合酶与扩增技术 – RT-PCR

LunaScript® 一步法多重 RT-PCR 试剂盒                              收藏

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#E1555L
250 reactions
9,629.00元

#E1555S
50 reactions
2,479.00元

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产品特性

·有独特的 Luna WarmStart 反转录酶和 Q5 热启动超保真 DNA 聚合酶
·可检测低至 0.01 pg 的人总 RNA
·多重检测能力适用于 ARTIC 测序方案
·适配体酶控技术为室温下建立反应体系及保持 24 小时的持久稳定打下基础
·在单独的闭合试管中一步完成 RT-PCR,即能节省时间、减少塑料用量,又能最大限度地减少污染。
 
 

产品概述

 LunaScript 一步法多重 RT-PCR 试剂盒为 cDNA 合成和 PCR 扩增提供了简化方案。其中的 5X 反应预混液含有 dNTPs,经优化适用于多重靶标检测,且操作便捷。其中的 25X 酶预混液含有 Luna WarmStart 反转录酶和 Q5 热启动超保真 DNA 聚合酶。适配体抑制酶活技术可对上述两种酶活进行双重温控,因此可室温建立反应体系,且预混体系可室温稳定保存 24 小时。该试剂盒具备强大的多重靶标扩增能力,适用于诊断、病原体检、病毒基因组测序等多种应用(例如:ARTIC SARS-CoV-2 测序方案,每个反应扩增 ~50 个扩增子)。

 
图 1:在单个 RT-PCR 反应中进行多重 RNA 靶标检测和鉴定
LunaScript® 一步法多重 RT-PCR 试剂盒--NEB酶试剂
LunaScript 一步法多重 RT-PCR 试剂盒 (NEB #E1555) 仅需添加 RNA 模板和基因特异性引物,即可在一次反应中对多个 cDNA 靶标进行合成和扩增。扩增后的 cDNA 产物可通过下游应用进行检测或鉴定,包括:二代测序、DNA 芯片、片段分析、电泳和传统的克隆/测序。
 
图 2:LunaScript 一步法多重 RT-PCR 试剂盒的灵敏度和多重检测性能卓越
LunaScript® 一步法多重 RT-PCR 试剂盒--NEB酶试剂
使用 LunaScript 一步法多重 RT-PCR 试剂盒 (NEB #E1555) 或 SuperScript IV One-Step RT-PCR System (Thermo Fisher Scientific) 对人脾总 RNA 的 7 个靶标(185–776 bp)进行扩增。取 40% 的 RT-PCR 反应产物进行琼脂糖凝胶(2%)电泳检测。LunaScript 使用标准反应条件:引物终浓度为 1 μM,退火时间为 1 分钟。SSIV 使用推荐反应条件无法扩增所有条带,因此还测试了其它关键参数:改变引物浓度和退火时间。结果显示:LunaScript 一步法多重 RT-PCR 试剂盒可成功扩增不同起始量 RNA 模板中的所有 7 个靶标,但 SuperScript IV One-Step RT-PCR System 经调整反应条件,甚至增模板量,都无法扩增所有靶标。
 
图 3:LunaScript 一步法多重 RT-PCR 试剂盒可完成 ARTIC SARS-CoV-2 测序方案
 LunaScript® 一步法多重 RT-PCR 试剂盒--NEB酶试剂
 使用 LunaScript 一步法多重 RT-PCR 试剂盒和来自 NEB (A) 或 IDT (B) ARTIC V3 引物进行多重扩增,扩增模板为 1000 拷贝 SARS-CoV-2 病毒 gRNA (ATCC VR-1986),该模板掺入到 100 ng 通用人类参考 RNA(Thermo Fisher Scientific®,QS0639)中使用。将 cDNA 合成体系一式两份成 12.5 μl 体系,分别使用引物库 1 和 2 进行扩增。反应条件为:55℃ 20 分钟(反转录),98℃ 1 分钟(RT 灭活/初始变性),之后进行 35 个循环的扩增:95℃ 15 秒,63℃ 5 分钟(退火和延伸)。

使用 NEBNext® ARTIC SARS-CoV-2 FS 文库制备试剂盒(适用于 Illumina 平台)和 1.3 μl 的上述扩增产物进行文库构建,使用 MiSeq® 仪器 (2X75 bp) 测序。为每个文库绘制每个扩增子的测序  Reads。使用 seqtk(250,000 read pairs)向下抽样 Reads 数,并使用 Bowtie 2 比对至 SARS-CoV-2 参考基因组(NCBI,NC_045512)。参考线表示 100 reads 的典型质量阈值。
 
图 4:试剂可室温放置长达 24 小时,RNA 的检测效果仍然灵敏和稳健
 LunaScript® 一步法多重 RT-PCR 试剂盒--NEB酶试剂
使用 LunaScript 一步法多重 RT-PCR 试剂盒 (NEB #E1555) 对 GAPDH 靶标(570 bp)进行扩增,样品为 0.01 ng-10 ng 的 Jurkat 总 RNA。反应体系在冰上建立并立即运行(对照)或在热循环前室温放置 1、4 或 24 小时。每种条件下都设有无模板对照(NTC)。结果显示:所有上样量均完成了高度灵敏和特异的靶标扩增,预混体系室温放置长达 24 小时后也达到了同样的效果。
 
图 5:LunaScript 与 OneTaq 一步法 RT-PCR 试剂盒的比较
 
 LunaScript® 一步法多重 RT-PCR 试剂盒--NEB酶试剂