T4 多聚核苷酸激酶–NEB酶试剂

产品资料 – RNA 试剂 – RNA 连接酶和修饰酶

T4 多聚核苷酸激酶                              收藏

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相关产品

T4 多聚核苷酸激酶(3´ 磷酸酶活性缺失)

特性

 DNA 或 RNA 5´ 末端的磷酸化,以便进行连接反应
 DNA 或 RNA 的末端标记,用作探针和进行 DNA 测序
 用 T4 多聚核苷酸激酶(NEB #M0201)除去 3´ 磷酸基团
 T4 多聚核苷酸激酶(3´ 磷酸酶活性缺失)(NEB #M0236)将 3´ 端已经磷酸化的单核苷酸 5´磷酸化,制备pNp  底物,用于添加到 DNA 或RNA的 3´ 端
 用 T4 多聚核苷酸激酶(3´ 磷酸酶活性缺失)(NEB #M0236)对 3´ 端有磷酸基团的寡核苷酸的 5´ 端   进行标记

概述

T4 多聚核苷酸激酶能够催化 ATP 的 γ-位磷酸基团转移到寡核苷酸链(双链或单链 DNA 或 RNA)的 5´ -羟基末端以及 3´ -单磷酸核苷上。T4 多聚核苷酸激酶(NEB #M0201)还具有 3´ 磷酸酶活性,将 3´ -磷酸基团从寡核苷酸的 3´ 磷酸末端、脱氧 3´ -单磷酸核苷和脱氧 3´ -二磷酸核苷上水解掉。经修饰后的酶(NEB #M0236)具有所有激酶的活性,但是缺失了 3´ 磷酸酶活性。  

来源

重组 E. coli 菌株,克隆有 T4 多聚核苷酸激酶基因。  

反应条件

1X T4 多聚核苷酸激酶反应缓冲液
[70 mM Tris-HCl(pH 7.6 @ 25℃),10 mM MgCl2,5 mM DTT],37℃ 温育。
热失活:65℃ 加热 20 分钟。  

注意事项

达到最佳酶活力,需要新鲜缓冲液(在旧缓冲液中,由于氧化造成的 DTT 含量减少会降低酶活力)。  

放射性标记反应:50 μl 反应体系中,用 1X T4 多聚核苷酸激酶反应缓冲液、50 pmol 的 γ-[32P] ATP 和 20 单位的酶 37℃ 温育 30 分钟可催化 1-50 pmol 的 5´ 末端磷酸化。[33P] ATP 可代替 [32P] ATP 作标记反应。

CTP、GTP、TTP、UTP、dATP 及 dTTP 均可替代 ATP 作为磷酸供体。

DNA 或 RNA 磷酸化反应(放射性和非放射性)操作流程请登陆 www.neb.com 或 www.neb-china.com。

要提高平齐末端或 5´ 凹陷末端的磷酸化效率,可在加入 T4 多聚核苷酸激酶前,先将 DNA 溶液于 70℃ 加热 5 分钟,然后冰上冷却,并加入 5%(w/v)的 PEG-8,000。

T4 多聚核苷酸激酶需要 ATP 才能发挥活性,但是为了适用于高活力的放射性标记反应,在随酶提供的反应缓冲液中不含 ATP。

一般来说,进行激酶反应之后是连接反应。在这种情况下,T4 多聚核苷酸激酶反应在连接酶反应缓冲液中 37℃ 温育 30 分钟即可。反应后的产物可直接进行连接,无需改变缓冲液和进行热失活。如果连接时需要保持其它 DNA 片段的去磷酸化状态,则需要在连接反应前热失活 T4 多聚核苷酸激酶。

 

质保声明

T4 多聚核苷酸激酶经过严格的质控检测,确保该产品具有最高的活性和纯度。详情请登陆 www.neb.com 或 www.neb-china.com。  

单位定义

1 单位即 1 个 Richardson 单位,指 37℃条件下,30 分钟内催化 1 nmol 酸不溶性 [32P] 掺入所需要的酶量(1)。单位活性检测条件请登陆 www.neb.com 或 www.neb-china.com。  

浓度

10,000 units/ml。  

参考文献

关于该酶性质和产品应用的参考文献,请登陆 www.neb.com 或 www.neb-china.com。  

T4 多聚核苷酸激酶反应


T4 多聚核苷酸激酶--NEB酶试剂
 
在 50 μl T4 多聚核苷酸激酶反应缓冲液体系中,37℃温育 30 分钟,γ-磷酸基团从 ATP 转移至 d(T)的 5´ 羟基末端 [ATP 与 d(T)8 比例是 1:1,量为 50 pmol],结果显示 20 单位酶量可使超过 90% 的磷酸基团转移。