Screen Quest cAMP检测试剂盒*比色ELISA法* 货号36370-AAT Bioquest荧光染料

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Screen Quest cAMP检测试剂盒*比色ELISA法*

Screen Quest cAMP检测试剂盒*比色ELISA法*

Screen Quest cAMP检测试剂盒*比色ELISA法*    货号36370 货号 36370 存储条件 在2-8度冷藏保存, 避免光照
规格 1 plate 价格 3840
Ex (nm) 650 Em (nm)
分子量 溶剂
产品详细介绍

简要概述

腺苷3’,5’环一磷酸(cAMP)是细胞内信号转导的第二信使。检测cAMP的水平是筛选GPCR激动剂和拮抗剂的最常用方法之一。 Screen Quest 比色ELISA cAMP分析试剂盒基于HRP标记的cAMP与未标记的cAMP之间的竞争。通过未标记的游离cAMP将HRP-cAMP从HRP-cAMP /抗cAMP抗体复合物中置换出来。在不存在cAMP的情况下,HRP-cAMP偶联物仅与抗cAMP抗体结合。然而,测试样品中未标记的游离cAMP与HRP-cAMP抗体偶联物竞争抗cAMP抗体,因此抑制了HRP-cAMP与抗cAMP抗体的结合。我们的Screen Quest 比色ELISA cAMP分析试剂盒提供了一种灵敏的方法,用于在生化或基于细胞的分析系统中检测腺苷酸环化酶的活性。与其他ELISA cAMP分析试剂盒相比,我们的试剂盒省去了繁琐的乙酰化步骤。该试剂盒使用Amplite Green作为比色底物来定量HRP活性。该测定可以使用96孔或384孔微孔板进行。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供最优质的Screen Quest cAMP检测试剂盒。

 

适用仪器


光吸收酶标仪  
吸收: 405, 650, or 740nm
推荐孔板: 透明孔板(试剂盒自带)

产品说明书

样品实验方案

简要概述

  1. 准备样品
  2. 将75 µL /孔的cAMP标准品或测试样品添加到抗cAMP的96孔板中
  3. 在室温下孵育5-10分钟
  4. 加入25 µL /孔的1X HRP-cAMP偶联物
  5. 在室温下孵育3小时
  6. 用200 µL /孔的洗涤缓冲液洗涤4次
  7. 添加100 µL /孔的Amplite Green
  8. 在室温下孵育1至3个小时
  9. 检测405、650或740 nm处的吸光度增加

 

溶液配制

储备溶液配制

1. cAMP储备溶液(100 µM):将1 mL测定缓冲液(组分B)添加到cAMP标准品(组分A)的小瓶中。

2. HRP-cAMP共轭原液(50X):将55 µL(#36370)或550 µL(#36371)的测定缓冲液(组分B)添加到HRP-cAMP偶联物(组分C)的小瓶中。 注意:未使用的50X HRP-cAMP共轭原液应分为一次性使用的等分试样,并在-20℃下保存。

3.洗涤液(1倍):将1 mL的10X洗涤溶液(组分D)添加到9 mL蒸馏水中。

 

标准溶液配制

在分析缓冲液(组分B)中对cAMP标准品进行1:10、1:100和1:3的系列稀释,以得到10,000、100、30、10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01和0.003 nM cAMP 稀释溶液。 存放在冰箱或4°C下。

 

工作溶液配制

HRP-cAMP偶联物工作溶液:
在使用前,用测定缓冲液(组分B)以1:50稀释,使其具有1X HRP-cAMP偶联物工作溶液。 存放在冰箱或4°C下。 注意:25 µL 1X HRP-cAMP偶联物工作溶液足以用于一个测定点; 准备适当的体积,仅供一次性使用,现配现用。

 

实验步骤

1.准备样品

1.1根据需要处理细胞:
以下是用Forskolin处理的Hela细胞以96孔板诱导cAMP的示例:吸出细胞生长培养基,在Hanks中加入100 µL /孔100μM Forskolin和20 mM Hepes缓冲液(HHBS),在5%CO2,37°C恒温箱,放置15分钟。孵育后吸出细胞溶液,加入100 µL /孔的细胞裂解缓冲液(组分E),然后在室温下另外孵育10分钟。该细胞裂解液可以直接测定,也可以在测定缓冲液(组分B)中稀释后测定。注意:应单独评估每个细胞系,以确定最佳细胞密度。细胞可以在实验的前一天或实验当天接种,具体取决于细胞类型和/或受试化合物的作用。

1.2组织样本:
由于组织中环状核苷酸的快速代谢,重要的是在收集后快速冷冻组织(例如,使用液氮)。称重冷冻的组织,并添加10-20 µL / mg细胞裂解缓冲液。在冰箱均质样品。高速旋转5分钟并收集上清液。上清液可以直接测定。

1.3尿液,血浆和培养基样品:
尿液和血浆可以直接在1X裂解缓冲液中以1:200至1:1000的稀释度进行测试。也可以在裂解缓冲液中以1:10至1:200的稀释度测试培养基。注意:RPMI介质可能包含> 350 fmol / µL cAMP。

 

2.cAMP测定

2.1所有测定孔均按以下顺序准备:A)cAMP标准品,对照或测试样品; B)HRP-cAMP偶联物。

2.2将75 µL /孔的cAMP稀释标准溶液和测试样品添加到抗cAMP Ab包被的96孔板(组分F)的每个孔中。 我们建议对每个标准品和测试样品重复测定。在室温下孵育5至10分钟。

2.3加入25 µL /孔的1X HRP-cAMP偶联物工作溶液。 将板放在摇床上,在室温下孵育3小时。

2.4吸出板内容物,并用200 µL /孔的1X洗涤液洗涤4次。

2.5在每个孔中加入100 µL /孔的Amplite Green(组分G),并在避光的情况下在室温下孵育60分钟至3小时。

2.6使用光吸收酶标仪检测在405 nm,650 nm或740 nm处的吸光度增加。

 

图示

Screen Quest cAMP检测试剂盒*比色ELISA法*    货号36370

图1.使用Screen Quest 比色ELISA cAMP分析试剂盒在透明的96孔板中使用SpectraMax酶标仪测量cAMP剂量反应。 可以在405 nm(蓝线),650 nm(红线)或740 nm(绿线)处读取吸光度,图B中的数据来自与Amplite Green孵育3小时的结果。

Screen Quest cAMP检测试剂盒*比色ELISA法*    货号36370

图2. cAMP剂量反应是通过Screen Quest 比色ELISA cAMP分析试剂盒在带有SpectraMax酶标仪的透明96孔板中测量的。 A:与Amplite Green孵育1小时(蓝线)和3小时(红线)后,该试剂盒在405nm的100 µL反应体积中可检测到低至0.1 nM cAMP。

 

 

参考文献

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说明书
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