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NO₂/NO₃ Assay kit-FX(Fluorometric)～2,3-Diaminonaphthalene Kit～

02 酸化ストレス関連試薬

NO₂/NO₃ Assay kit-FX(Fluorometric)～2,3-Diaminonaphthalene Kit～

酸化ストレス関連試薬

NO検出関連試薬

製品コード

NK08　 NO₂/NO₃ Assay kit-FX(Fluorometric)～2,3-Diaminonaphthalene Kit～

容　量	メーカー希望小売価格	富士フイルム和光純薬
200 tests	￥33,600	345-08141

キット内容

200 tests	・Buffer Solution ・NaNO2 Standard Solution (200μmol/l) ・NaNO3 Standard Solution (200μmol/l) ・NO₃ Reductase ・Enzyme Cofactors ・Fluorescence Reagent (DAN) Solution ・Stop Solution	×1 ×2 ×2 ×2 ×2 ×1 ×1

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技術情報

キット以外に必要なもの

・蛍光マイクロプレートリーダー（λ_ex=360 nm～365 nm、λ_em=450～465 nmのフィルターを備えたもの）
・96穴マイクロプレート　・マイクロピペット　・チップおよびシリンジ

＊測定試料によっては除蛋白用の装置、試薬も必要となる。

参考文献

参考文献を表示する

1) P. Damiani, G. Burini, "Fluorometric Determination of Nitrite", Talanta, 1986, 33, 649.
2) 向日良夫, 原久子, 谷口寛一, "2, 3-ジアミノナフタレンを用いる亜硝酸及び亜硝酸アミルの蛍光定量", 分析化学, 1991, 40, 105.
3) T. P. Misko, R. J. Schilling, D. Salvemini, W. M. Moore and M. G. Currie, "A Fluorometric Assay for the Measurement of Nitrite in Biological Samples", Anal. Biochem., 1993, 214, 11.
4) A. H. Cross, T. P. Misko, R. F. Lin, W. F. Hickey, J. L. Trotter and R. G. Tilton, "Aminoguanidine, an Inhibitor of Inducible Nitric Oxide Synthase, Ameliorates Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in SJL Mice", J. Clin. Invest., 1994, 93, 2684.
5) D. Salvemini, K. Seibert, J. L. Masferrer, T. P. Misko, M. G. Currie and P. Needleman, "Endogenous Nitric Oxide Enhances Prostaglandin Production in a Model of Renal Inflammation", J. Clin. Invest., 1994, 93, 1940.
6) R. G. Tilton, K. Chang, J. A. Corbett, T. P. Misko, M. G. Currie, N. S. Bora, H. J. Kaplan and J. R. Williamson, "Endotoxin-Induced UVeitis in the Rat Is Attenuated by Inhibition of Nitric Oxide Production", Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 1994, 35, 3278.
7) A. Ishikawa, Y. Katano, M. Nakamura, K. Doi, K. Tasaki and A. Ono, "Differential Modulation of Nitric Oxide and Prostacyclin Release in Senescent Rat Heart Stimulated by Angiotensin II", Eur. J. Pharmacol., 1999, 382, 19.
8) K. Ohkusu, T. Yoshimoto, K. Takeda, T. Ogura, S. Kashiwamura, Y. Iwakura, S. Akira, H. Okumura and K. Nakanishi, "Potentiality of Interleukin-18 as a Useful Reagent for Treatment and Prevention of Leishmania major Infection", Infect. Immun., 2000, 68, 2449.
9) S. Igawa, I. Hayashi, N. Tanaka, H. Himura, M. Majima, T. Kawakami, M. Hirose, N. Masuda and H. Kobayashi, "Nitric Oxide Generated by iNOS Reduces Deformability of Lewis Lung Carcinoma Cells", Cancer Sci., 2004, 95, 342.

よくある質問

Q NO₂/NO₃ Assay Kit-C Ⅱ(Colorimetric) ～Griess Reagent Kit～との違いは何ですか？: A

主な違いは以下の通りです。詳細は製品情報をご確認下さい。
１．検出方法

　　Kit-CⅡは吸光度測定、Kit-FXは蛍光測定です。それぞれ対応したマイクロプレートリーダー等をご利用下さい。

２．測定範囲

　　Kit-CⅡは10～100μmol/L のNO₂^–/NO₃^–濃度の測定に、Kit-FXは1～10μmol/L のNO₂^–/NO₃^–濃度の測定に適しています。

３．阻害物質

　　フェノールレッドを含む培地は、Kit-CⅡでは使用可能ですが、Kit-FXでは使用できません。

Q サンプルの前処理方法を教えて下さい。: A

＜血清＞
除蛋白が必要です。
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane ([UFC801008], Millipore 社) などで除タンパク（例えば7000 xg, 20 min, 4℃）して
測定試料として下さい。

トリクロロ酢酸を用いた除タンパクでも結構です。ただし、酸で除タンパクした場合は、測定前に必ずpHを中性に戻してから使用して下さい。
酵素反応が阻害をうける可能性があります。

＜尿＞
除蛋白が必要です。血清の除蛋白操作を参考に、除蛋白操作を行って下さい。

＜細胞培養液＞
遠心分離（例えば1000g, 15min, 室温)し、上澄みをサンプルとして下さい。
血清を添加している場合は、除蛋白を行って下さい。
血清のタンパク成分の影響で、NO₂^–/NO₃^–濃度が低く出る可能性があります。

＜組織＞　（例：マウス皮膚）
マウス皮膚をホモジナイズ遠心後（例えば、7,740 x g）の上澄みをUltrafree-MC centrifuge device(UFC3; Millipore社)などで除タンパクして測定試料としてください。

※組織前処理の参考文献：K. Nakai, et al., "Free radical production requires both inducible nitric oxide synthase and xanthine oxidase in LPS-treated skin",
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006, 103(12), 4616-4621.

Q 金属による測定への影響: A

金属によっては影響します。

Fe(2価および3価)は0.1mmol/L くらいから蛍光強度の減少が見られます。
金属に対して等量か過剰のEDTAを加えることで影響を回避することができます。

その他の金属(Cu,Zn,Mg,Ca) は1 mmol/L まで影響が見られません。

Q 使用できない培地は何でしょう？: A

硝酸塩が多く含まれる培地は使用出来ません（RPMI1640など）その他、フェノールレッド、出来れば血清も、含まない培地をご使用ください。

＊注：[NO₂^–]のみの測定であれば可能ですが、[NO₂^–/NO₃^–]のトータルの濃度測定は出来ません。

＜硝酸塩＞

　Kit-FXの場合、1～10 μmol/L のNO₂/NO₃濃度の測定に適しています。
　例えば、RPMI 1640の場合、NO₃が800 μmol/L 添加されていますので、測定限界をはるかに超えています。

　代表的な培地ですと
　『MEM』大部分の種類のものが硝酸を含んでおりませんので、硝酸を含んでいないものをお使いください。

　いずれの培地にしろ（勿論RPMI 1640は除きますが）、やむを得ず硝酸を含んだものをお使いになり、その影響が気になる場合は、サンプルに含まれる量と同量の培地のみで測定してブランクとして差し引いてください。
　培地のカタログに組成表が記載してありますので、測定前にご確認ください。

＜フェノールレッド＞
　反応の最後に[Stop solution]を添加しますが、これはアルカリ性溶液になっています。(蛍光を発するため)フェノールレッドが含まれていると[Stop solution]を添加後、培地が黒くなり蛍光が測定できません。

＜血清＞
　血清の中には元々、NO₂/NO₃が含まれております。
　そのため、血清を含む培地の場合には、培地を緩衝液で『希釈』していただく必要が生じます。

Q 試料を、前処理前に保存することはできますか？: A

-20℃で保管していただければ、保存は可能です。
-20℃で保管した血清は、凍結前と２ヶ月間凍結した後で、データに差がないことを確認しております。

しかし、試料中にNO_xを分解するような物質（微生物など）が含まれると安定性が確保できませんので、ご注意下さい。

Q 測定を阻害する物質は、どのようなものがありますか？: A

硝酸塩が多く含まれる培地（RPM 1640など)中では、測定ができません。
詳しくは「使用できない培地は何でしょう？」のQ&Aをご参照下さい。

タンパク質や金属（Fe, Cu, Zn, Ca, Mgなど）が入っていると測定に影響が出ます。

試料は前処理の段階で、除タンパク操作を行って下さい。

金属はキレート剤（EDTAなど)を加えることで影響を回避できます。

詳しくは「金属による測定の影響」のQ&Aをご参照下さい。