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NO検出関連試薬 Carboxy-PTIO　同仁化学研究所

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NO検出関連試薬 Carboxy-PTIO　同仁化学研究所Carboxy-PTIO

02 酸化ストレス関連試薬

Carboxy-PTIO

NO検出関連試薬 Carboxy-PTIO　同仁化学研究所

  • 酸化ストレス関連試薬

NO検出関連試薬

  • 製品コード
    C348　 Carboxy-PTIO
  • CAS番号
    148819-93-6
  • 化学名
    2-(4-Carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide, sodium salt
  • 分子式・分子量
    C14H16N2NaO4=299.28
容　量 メーカー希望
小売価格		 富士フイルム
和光純薬
10 mg ￥14,400 344-07011
  • NO検出関連試薬 Carboxy-PTIO　同仁化学研究所
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マニュアル

  • プロトコル NO検出関連試薬 Carboxy-PTIO　同仁化学研究所 NO を消去したい
    NO検出関連試薬 Carboxy-PTIO　同仁化学研究所

技術情報

注意事項

・本製品を粉末の状態で取り出し使用する場合、性状の性質上、静電気等の要因で容器内に付着し、取り出しにくい場合があります。
・容器内に付着し、取り出せなかった粉末に関しては、使用する溶媒を容器に入れ、溶かし出して使用してください。

参考文献

参考文献を表示する

1) E. F. Ullman, J. H. Osieki, D. G. B. Boocock and R. Darcy, "Studies of Stable Free Radicals. X. Nitronyl Nitroxide Monoradicals and Biradicals as Possible Small Molecule Spin Labels", J. Am. Chem. Soc., 1972, 94, 7049.
2) Y. Miura, K. Nakai and M. Kinoshita, "Polymers Containing Stable Free Raficals, 5. Preparation of a Polymer Containing Imidazoline 3-Oxide 1-Oxyl Groups", Makromol. Chem., 1973, 172, 233.
3) K. Inoue and H. Iwamura, "Magnetic Properties of the Crystals of p-(1-Oxyl-3-Oxide-4,4,5,5-Tetramethyl-2-Imidazolin-2-Yl)Benzoic acid and Its Alkali Metal Salts", Chem. Phys. Lett., 1993, 207, 551.
4) T. Akaike, M. Yoshida, Y. Miyamoto, K. Sato, M. Kohno, K. Sasamoto, K. Miyazaki, S. Ueda and H. Maeda, "Antagonistic Action of Imidazolineoxyl N-Oxides Against Endothelium-Derived Relaxing Factor/NO Through a Radical Reaction", Biochemistry, 1993, 32, 827. 
5) J. Joseph, B. Kalyanaraman and J. S. Hyde, "Trapping of Nitric Oxide by Nitronyl Nitroxides: an Electron Spin Resonance Investigation", Biochem. Biophys. Res. Commun., 1993, 192, 926. 
6) M. Yoshida, T. Akaike, Y. Wada, K. Sato, K. Ikeda, S. Ueda and H. Maeda, "Therapeutic Effects of Imidazolineoxyl N-Oxide Against Endotoxin Shock Through Its Direct Nitric Oxide-scavenging Activity", Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994, 202, 923. 
7) T. Az-Ma, K. Fujii and O. Yuge, "Reaction Between Imidazolineoxil N-Oxide(Carboxy-PTIO) and Nitric Oxide Released from Cultured Endothelial Cells:Quantitative Measurement of Nitric Oxide by ESR Spectrometry", Life Sci., 1994, 54, 185. 
8) H. Maeda, T. Akaike, M. Yoshida and M. Suga, "Multiple Functions of Nitric Oxide in Pathophysiology and Microbiology: Analysis by a New Nitric Oxide Scavenger", J. Leukoc. Biol., 1994, 56(5), 588. 
9) T. Akaike and H. Maeda, "Quantitation of Nitric Oxide Using 2-Phenyl-4,4,5,5-Tetramethylimidazoline-1-Oxyl 3-Oxide(PTIO)", Methods Enzymol., 1996, 268, 211. 
10) S. Satoh, T. Kimura, M. Toda, H. Miyazaki, S. Ono, H. Narita, T. Murayama and Y. Nomura, "NO Donors Stimulate Noradrenaline Release from Rat Hippocampus in a Calmodulin-dependent Manner in the Presence of L-Cysteine", J. Cell. Physiol., 1996, 169, 87. 
11) V. V. Khramtsov, D. I. Utepbergenov, Ya. Yu. Woldman, L. P. Vlassenko, A. L. Markel, I. A. Kiriljuk, I. A. Grigor'ev, D. G. Mazhukin, A. Ya. Tikhonov and L. B. Volodarsky, "In vitro and in vivo Studies of Derivatives of 1,2-Diazetine and Nitronylnitroxide as Donors and Acceptors of Nitric Oxide", Biochemistry(Moscow), 1996, 61(10), 1223. 
12) D. C. Hooper, O. Bagasra, J. C. Marini, A. Zborek, S. T. Ohnishi, R. Kean, J. M. Champion, A. B. Sarker, L. Bobroski, J. L. Farber, T. Akaike, H. Maeda and H. Koprowski, "Prevention of Experimental Allergic Encephalomyelitis by Targeting Nitric Oxide and Peroxynitrite: Implications for the Treatment of Multiple Sclerosis", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 2528. 
13) S. Pfeiffer, E. Leopold, B. Hemmens, K. Schmidt, E. R. Werner and B. Mayer, "Interference of carboxy-PTIO with Nitric-Oxide and Peroxynitrite-Mediated Reactions", Free Radic. Biol. Med., 1997, 22, 787. 
14) Y. Nakashima, H. Yasui and H. Sakurai, "A New Determination Method of Nitric Oxide (NO) with a NO-selective Electrode Demonstrated by the Kinetic Analysis of NO Generation and Decomposition", Chem. Lett., 2002, 12, 1214.<

よくある質問

Q

Carboxy-PTIOの溶解方法を教えてください。

A

純水あるいはバッファー溶液(pH 6 以上)などに溶解してください。
 
＜調製例＞
Carboxy-PTIO 3.0 mg を量り取り、10 mmol/L PBS10 mLに溶解する（1 mmol/L Carboxy-PTIO溶液）。
希釈濃度になるように、1 mmol/L Carboxy-PTIO溶液を一定量試料に添加する。
※1 mmol/L Carboxy-PTIO溶液は保存せず、その日のうちにお使いください。

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取扱条件

規格
性状： 本品は、暗青色～黒色粉末でメチルアルコールに溶ける。
純度(TLC)： 97.0％ 以上
HEPES緩衝液溶状： 試験適合
Carboxy-PTI含量(ESR)： 試験適合
取扱条件
1.保存方法：冷凍,遮光
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NO検出関連試薬 2,3-Diaminonaphthalene(for NO detection)　同仁化学研究所

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NO検出関連試薬 2,3-Diaminonaphthalene(for NO detection)　同仁化学研究所2,3-Diaminonaphthalene(for NO detection)

02 酸化ストレス関連試薬

2,3-Diaminonaphthalene(for NO detection)

NO検出関連試薬 2,3-Diaminonaphthalene(for NO detection)　同仁化学研究所

  • 酸化ストレス関連試薬

NO検出関連試薬

  • 製品コード
    D418　 2,3-Diaminonaphthalene(for NO detection)
  • CAS番号
    771-97-1
  • 化学名
    2,3-Diaminonaphthalene
  • 分子式・分子量
    C10H10N2=158.2
容　量 メーカー希望
小売価格		 富士フイルム
和光純薬
10 mg ￥6,200 341-07021
  • NO検出関連試薬 2,3-Diaminonaphthalene(for NO detection)　同仁化学研究所
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技術情報

注意事項

・本製品を粉末の状態で取り出し使用する場合、性状の性質上、静電気等の要因で容器内に付着し、取り出しにくい場合があります。
・容器内に付着し、取り出せなかった粉末に関しては、使用する溶媒を容器に入れ、溶かし出して使用してください。

取扱条件

規格
性状： 本品は、白色～淡黄褐色粉末で、熱水、熱アルコール及び希塩酸等に溶ける。
希塩酸溶状： 試験適合
融点： 185～200℃
NO測定適合性： 試験適合
IRスペクトル： 試験適合
取扱条件
1.保存方法：冷凍,遮光
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NO検出関連試薬 DTCS Na　同仁化学研究所

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NO検出関連試薬 DTCS Na　同仁化学研究所DTCS Na

02 酸化ストレス関連試薬

DTCS Na

NO検出関連試薬 DTCS Na　同仁化学研究所

  • 酸化ストレス関連試薬

NO検出関連試薬

  • 製品コード
    D465　 DTCS Na
  • CAS番号
    13442-87-0
  • 化学名
    N-(Dithiocarboxy)sarcosine, disodium salt, dihydrate
  • 分子式・分子量
    C4H5NNa2O2S2･2H2O=245.23
容　量 メーカー希望
小売価格		 富士フイルム
和光純薬
100 mg ￥12,400 349-07321
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  • プロトコル NO検出関連試薬 DTCS Na　同仁化学研究所 NO をin vivo ESR で検出したい
    NO検出関連試薬 DTCS Na　同仁化学研究所

技術情報

溶解例

50 mg/mL（水）

参考文献

参考文献を表示する

1) 藤井敏司, "鉄2価錯体を用いた内因性NOのESRによる検出", 化学と工業, 1994, 47(10), 1330. 
2) T. Yoshimura, S. Fujii, H. Yokoyama and H. Kamada, "In vivo Electron Paramagnetic Resonance Imaging of NO-Bound Iron Complex in a Rat Head", Chem. Lett., 1995, 309. 
3) S. Fujii, G. Miyakoda, M. Chihiro, T. Yoshimura and H. Kamada, "Nitric Oxide Release from Porcine Aorta Endothelial Cells Measured by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy", Chem. Lett., 1996, 1055. 
4) S. Fujii, T. Yoshimura and H. Kamada, "Nitric Oxide Trapping Efficiencies of Water-soluble Iron(III) Complexes with Dithiocarbamate Derivatives", Chem. Lett., 1996, 785. 
5) T. Yoshimura, H. Yokoyama, S. Fujii, F. Takayama, K. Oikawa and H. Kamada, "In vivo EPR Detection and Imaging of Endogenous Nitric Oxide in Lipopolysaccharide-treated Mice", Nature Biotechnology, 1996, 14, 992. 
6) B. Kalyanaraman, "Detectionof Nitric Oxide by Electron Spin Resonance in Chemical, Photochemical, Cellular, Physiological, and Pathophysiological Systems", Methods Enzymol., 1996, 268(A), 168. 
7) H. Yokoyama, S. Fujii, T. Yoshimura, H. Ohya-Nishiguchi and H. Kamada, "In vivo ESR-CT Imaging of the Liver in Mice Receiving Subcutenous Injection of Nitric Oxide-Bound Iron Complex", Magn. Reson. Imaging., 1997, 15, 249.

取扱条件

規格
性状： 本品は、白色～微黄色粉末で水に溶ける。
水溶状： 試験適合
ナトリウム(Na)： 15.0％ 以上
取扱条件
1.保存方法：冷蔵,遮光
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関連製品

NO検出関連試薬 NO2/NO3 Assay Kit-C Ⅱ(Colorimetric) ～Griess Reagent Kit～　同仁化学研究所

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NO検出関連試薬 NO2/NO3 Assay Kit-C Ⅱ(Colorimetric) ～Griess Reagent Kit～　同仁化学研究所NO2/NO3 Assay Kit-C Ⅱ(Colorimetric) ～Griess Reagent Kit～

02 酸化ストレス関連試薬

NO2/NO3 Assay Kit-C Ⅱ(Colorimetric) ～Griess Reagent Kit～

NO検出関連試薬 NO2/NO3 Assay Kit-C Ⅱ(Colorimetric) ～Griess Reagent Kit～　同仁化学研究所

  • 酸化ストレス関連試薬

NO検出関連試薬

  • 製品コード
    NK05　 NO2/NO3 Assay Kit-C Ⅱ(Colorimetric) ～Griess Reagent Kit～
容　量 メーカー希望
小売価格		 富士フイルム
和光純薬
100 回用 ￥33,600 344-07991
キット内容
100 回用 ・NaNO2 標準溶液 (100 μmol/l)
・NaNO3 標準溶液 (100 mol/l)
・緩衝溶液 (20 mmol/l、pH 7.6)
・還元酵素
・補酵素
・試薬A
・試薬B		 x1
x1
x1
x1
x1
x1
x1

  • NO検出関連試薬 NO2/NO3 Assay Kit-C Ⅱ(Colorimetric) ～Griess Reagent Kit～　同仁化学研究所
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  • 取扱説明書 NO検出関連試薬 NO2/NO3 Assay Kit-C Ⅱ(Colorimetric) ～Griess Reagent Kit～　同仁化学研究所 日本語
    NO検出関連試薬 NO2/NO3 Assay Kit-C Ⅱ(Colorimetric) ～Griess Reagent Kit～　同仁化学研究所
  • 取扱説明書 NO検出関連試薬 NO2/NO3 Assay Kit-C Ⅱ(Colorimetric) ～Griess Reagent Kit～　同仁化学研究所 English
    NO検出関連試薬 NO2/NO3 Assay Kit-C Ⅱ(Colorimetric) ～Griess Reagent Kit～　同仁化学研究所
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技術情報

キット以外に必要なもの

・マイクロプレートリーダー　・96穴マイクロプレート　・マイクロピペット　・チップ及びシリンジ

＊測定試料によっては除蛋白用の装置、試薬も必要となる。

参考文献

参考文献を表示する

1) L. J. Ignarro, G. M. Buga, K. S. Wood, R. E. Byrns and G. Chaudhuri, "Endothelium-Derived Relaxing Factor Produced and Released from Artery and Vein in Nitric Oxide", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 9265.
2) W. R. Tracey, J. Linden, M. J. Peach and R. A. Johns, "Comparison of Spectrophotometric and Biological Assays for Nitric Oxide (NO) and Endothelium-Derived Relaxing Factor (EDRF): Nonspecificity of the Diazotization Reaction for NO and Failure to Detect EDRF", J. Pharmacol. Exp. Ther., 1990, 252(2), 922.
3) J. S. Pollock, U. Forstermann, J. A. Mitchell, T. D. Warner, H. H. H. W. Schmidt, M. Nakane and F. Murad, "Purification and Characterization of Particulate Endothelium-derived Relaxing Factor Synthesis from Cultured and Native Bovine Aortic Endothelial Cells", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 10480.
4) H. H. H. W. Schmidt, T. D. Warner, M. Nakane, U. Forstermann and F. Murad, "Regulation and Subcellular Location of Nitrogen Oxide Synthases in RAW264. 7 Macrophages", Mol. Pharmacol., 1992, 41, 615.
5) S. Archer, "Measurement of Nitric Oxide in Biological Models", FASEB J., 1993, 7, 349.
6) M. B. Gilliam, M. P. Sherman, J. M. Griscavage and L. J. Ignarro, "A Spectrophotometric Assay for NADPH Oxidaton by Aspergillus Nitrate Reductase", Anal. Biochem., 1993, 212, 359.
7) S. Bodis and A. Haregewoin, "Significantly Reduced Salivary Nitric Oxide Levels in Smokers", Ann. Oncol, 1994, 5, 371.
8) D. S. A. Majid, M. Godfrey, M. B. Grisham and L. G. Navar, "Relation Between Pressure Natriuresis and Urinary Excretion of Nitrate/Nitrite in Anesthetized Dogs", Hypertension, 1995, 25, 860.
9) H. Trachtman, B. Gauthier, A. Goldstein and J. Tomczak, "Increased Urinary Nitrite Excretion in Children with Minimal change Nephrotic Syndrome", J. Pediatr., 1996, 128, 173.
10) D. L. Granger, R. R. Taintor, K. S. Boockvar and J. B. Hibbs Jr., "Mesurement of Nitrate and Nitrite in Biological Samples Using Nitrate Reductase and Griess Reaction", Methods in Enzymol., 1996, 268(A), 142.
11) G. Giovannoni, J. M. Land, G. Keir, E. J. Thompson and S. J. R. Heales, "Adaptation of the Nitrate Reductase and Griess reaction Methods for the Measurement of Serum Nitrate Plus Nitrate Levels", Ann. Clin. Biochem., 1997, 34, 193.
12) I. Guevara, J. Iwanejko, A. Dembinska-Kiec, J. Pankiewicz, A. Wanat, P. Anna, I. Golabek, S. Bartus, M. Malczewska-Malec and A. Szczudik, "Determination of Nitrite/Nitrate in Human Biological Material by the Simple Griess Reaction", Clin. Chem. Acta., 1998, 274, 177.

よくある質問

Q

NO2/NO3 Assay Kit-FX(Fluorometric)～2,3-Diaminonaphthalene Kit～との違いは何ですか？

A

主な違いは以下の通りです。詳細は製品情報をご確認下さい。

１．検出方法

　　Kit-CⅡは吸光度測定、Kit-FXは蛍光測定です。それぞれ対応したマイクロプレートリーダー等をご利用下さい。

２．測定範囲

　　Kit-CⅡは10～100 μmol/LのNO2-/NO3-濃度の測定に、Kit-FXは1～10 μmol/LのNO2–/NO3–濃度の測定に適しています。

３．阻害物質

　　フェノールレッドを含む培地は、Kit-CⅡでは使用可能ですが、Kit-FXでは使用できません。

Q

サンプルの前処理方法を教えて下さい。

A

＜血清＞
除蛋白が必要です。
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane ([UFC801008], Millipore 社) などで除タンパク（例えば7000 xg, 20 min, 4℃） して
測定試料として下さい。

トリクロロ酢酸を用いた除タンパクでも結構です。ただし、酸で除タンパクした場合は、測定前に必ずpHを中性に戻してから使用して下さい。
酵素反応が阻害をうける可能性があります。

＜尿＞
除蛋白が必要です。血清の除蛋白操作を参考に、除蛋白操作を行って下さい。

＜細胞培養液＞
遠心分離（例えば1000 xg, 15min, 室温)し、上澄みをサンプルとして下さい。
血清を添加している場合は、除蛋白を行って下さい。
血清のタンパク成分の影響で、NO2–/NO3–濃度が低く出る可能性があります。

＜組織＞　（例：マウス皮膚）
マウス皮膚をホモジナイズ遠心後（例えば、7,740 xg）の上澄みをUltrafree-MC centrifuge device(UFC3; Millipore社)などで
除タンパクして測定試料としてください。

※組織前処理の参考文献：K. Nakai, et al., "Free radical production requires both inducible nitric oxide synthase and xanthine oxidase in LPS-treated skin",
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006, 103(12), 4616-4621.

Q

以前、NO2/NO3 Assay Kit-C(Colorimetric) ～Griess Reagent Kit～というものが 販売されていましたが、現在のキットとどのように違うのでしょうか？

A

以前のタイプのものは、サンプルに血清や培地を使用した場合、
NO3をNO2に還元する際の酵素反応に阻害が見られました。
そのため、血清や培地を使用する際はサンプルを3～5倍に希釈するようにしていました。

現在のNO2/NO3 Assay Kit-C Ⅱ(Colorimetric) ～Griess Reagent Kit～　
は酵素・補酵素を改良することにより、血清や培地を使用する際にも希釈せず
使用できるようにしました。

反応の原理、その他の注意事項は以前と変わりません。
現在のキットでもサンプルの除蛋白は必要ですので、ご注意ください。

Q

サンプル中にZn(亜鉛)などの重金属があると測定値に影響するでしょうか？ （アルカリによる除タンパクの際にZnSO4を使用します）

A

影響します。

サンプル中にZnが数百μM以上の濃度で存在するとNO3–は殆ど還元されません。
Znの他に、Cuについても同様の影響が見られます。

ただしこれらの影響は微量金属に対して等量か過剰のEDTAを加えることで
影響を回避することができます。

Q

血液をサンプルとして使用する際の抗凝固剤は何がよいでしょうか？

A

EDTA類をご使用ください。

ヘパリンは必要最低限の量であれば、ほとんど影響ありませんが、

濃度が高くなると発色反応や酵素反応に影響します。

Q

培地を使用する場合、使用できない培地があるということですが、 どのような培地が使用できないのでしょうか？

A

硝酸塩が多く含まれる培地は使用出来ません（RPMI1640など）

＊注：[NO2–]のみの測定であれば可能ですが、[NO2–/NO3–]のトータルの濃度測定は出来ません。

Kit-C IIの場合、10～100 μMのNO2/NO3濃度の測定に適しています。
例えば、RPMI1640の場合、NO3が800 μM添加されていますので、測定限界をはるかに超えています。
ブランクとして差し引く場合でも、許容できるとすれば、10～20 μM程度です。

代表的な培地ですと
『MEM』大部分の種類のものが硝酸を含んでおりませんので、
　　　　出来れば硝酸を含んでいないものをお使いください。

『DMEM』硝酸を含んでおりますが、濃度としては1 μmol/L以下程度です。
　　　　これはほぼ無視しても良いレベルなのではないかと考えています。

いずれの培地にしろ（勿論RPMI 1640は除きますが）、やむを得ず硝酸を含んだものをお使いになり、
その影響が気になる場合は、サンプルに含まれる量と同量の培地のみで測定してブランクとして差し引いて頂くと良いです。
培地のカタログに組成表が記載してありますので、測定前にご確認ください。

Q

試料を、前処理する前に保存できますか？

A

 -20℃で保管していただければ、保存は可能です。

-20℃で保管した血清は、凍結前と２ヶ月間凍結した後で、データに差がないことを確認しております。

しかし、試料中にNOxを分解するような物質（微生物など）が含まれると安定性が確保できませんので、ご注意下さい。

Q

測定を阻害する物質は、どのようなものがありますか？

A

硝酸塩が多く含まれる培地（RPM1640など)中では、測定ができません。

詳しくは「使用できない培地は何でしょう？」のQ&Aをご参照下さい。

タンパク質や金属（Fe, Cu, Zn, Ca, Mgなど）が入っていると測定に影響が出ます。

試料は前処理の段階で、除タンパク操作を行って下さい。

金属はキレート剤（EDTAなど)を加えることで影響を回避できます。

詳しくは「金属による測定の影響」のQ&Aをご参照下さい。

NO検出関連試薬 NO2/NO3 Assay Kit-C Ⅱ(Colorimetric) ～Griess Reagent Kit～　同仁化学研究所 NO検出関連試薬 NO2/NO3 Assay Kit-C Ⅱ(Colorimetric) ～Griess Reagent Kit～　同仁化学研究所

取扱条件

取扱条件
1.保存方法：冷蔵
危険・有害
シンボルマーク 		NO検出関連試薬 NO2/NO3 Assay Kit-C Ⅱ(Colorimetric) ～Griess Reagent Kit～　同仁化学研究所NO検出関連試薬 NO2/NO3 Assay Kit-C Ⅱ(Colorimetric) ～Griess Reagent Kit～　同仁化学研究所
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関連製品

NO検出関連試薬 NO2/NO3 Assay kit-FX(Fluorometric)～2,3-Diaminonaphthalene Kit～　同仁化学研究所

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NO検出関連試薬 NO2/NO3 Assay kit-FX(Fluorometric)～2,3-Diaminonaphthalene Kit～　同仁化学研究所NO2/NO3 Assay kit-FX(Fluorometric)～2,3-Diaminonaphthalene Kit～

02 酸化ストレス関連試薬

NO2/NO3 Assay kit-FX(Fluorometric)～2,3-Diaminonaphthalene Kit～

NO検出関連試薬 NO2/NO3 Assay kit-FX(Fluorometric)～2,3-Diaminonaphthalene Kit～　同仁化学研究所

  • 酸化ストレス関連試薬

NO検出関連試薬

  • 製品コード
    NK08　 NO2/NO3 Assay kit-FX(Fluorometric)～2,3-Diaminonaphthalene Kit～
容　量 メーカー希望
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和光純薬
200 tests ￥33,600 345-08141
キット内容
200 tests ・Buffer Solution
・NaNO2 Standard Solution (200μmol/l)
・NaNO3 Standard Solution (200μmol/l)
・NO3 Reductase
・Enzyme Cofactors
・Fluorescence Reagent (DAN) Solution
・Stop Solution　		 ×1
×2
×2
×2
×2
×1
×1

  • NO検出関連試薬 NO2/NO3 Assay kit-FX(Fluorometric)～2,3-Diaminonaphthalene Kit～　同仁化学研究所
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マニュアル

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技術情報

キット以外に必要なもの

・蛍光マイクロプレートリーダー（λex=360 nm～365 nm、λem=450～465 nmのフィルターを備えたもの）
・96穴マイクロプレート　・マイクロピペット　・チップおよびシリンジ

＊測定試料によっては除蛋白用の装置、試薬も必要となる。

参考文献

参考文献を表示する

1) P. Damiani, G. Burini, "Fluorometric Determination of Nitrite", Talanta, 1986, 33, 649. 
2) 向日良夫, 原久子, 谷口寛一, "2, 3-ジアミノナフタレンを用いる亜硝酸及び亜硝酸アミルの蛍光定量", 分析化学, 1991, 40, 105.
3) T. P. Misko, R. J. Schilling, D. Salvemini, W. M. Moore and M. G. Currie, "A Fluorometric Assay for the Measurement of Nitrite in Biological Samples", Anal. Biochem., 1993, 214, 11. 
4) A. H. Cross, T. P. Misko, R. F. Lin, W. F. Hickey, J. L. Trotter and R. G. Tilton, "Aminoguanidine, an Inhibitor of Inducible Nitric Oxide Synthase, Ameliorates Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in SJL Mice", J. Clin. Invest., 1994, 93, 2684.
5) D. Salvemini, K. Seibert, J. L. Masferrer, T. P. Misko, M. G. Currie and P. Needleman, "Endogenous Nitric Oxide Enhances Prostaglandin Production in a Model of Renal Inflammation", J. Clin. Invest., 1994, 93, 1940. 
6) R. G. Tilton, K. Chang, J. A. Corbett, T. P. Misko, M. G. Currie, N. S. Bora, H. J. Kaplan and J. R. Williamson, "Endotoxin-Induced UVeitis in the Rat Is Attenuated by Inhibition of Nitric Oxide Production", Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 1994, 35, 3278.
7) A. Ishikawa, Y. Katano, M. Nakamura, K. Doi, K. Tasaki and A. Ono, "Differential Modulation of Nitric Oxide and Prostacyclin Release in Senescent Rat Heart Stimulated by Angiotensin II", Eur. J. Pharmacol., 1999, 382, 19.
8) K. Ohkusu, T. Yoshimoto, K. Takeda, T. Ogura, S. Kashiwamura, Y. Iwakura, S. Akira, H. Okumura and K. Nakanishi, "Potentiality of Interleukin-18 as a Useful Reagent for Treatment and Prevention of Leishmania major Infection", Infect. Immun., 2000, 68, 2449.
9) S. Igawa, I. Hayashi, N. Tanaka, H. Himura, M. Majima, T. Kawakami, M. Hirose, N. Masuda and H. Kobayashi, "Nitric Oxide Generated by iNOS Reduces Deformability of Lewis Lung Carcinoma Cells", Cancer Sci., 2004, 95, 342.

よくある質問

Q

NO2/NO3 Assay Kit-C Ⅱ(Colorimetric) ～Griess Reagent Kit～ との違いは何ですか？

A

主な違いは以下の通りです。詳細は製品情報をご確認下さい。
１．検出方法

　　Kit-CⅡは吸光度測定、Kit-FXは蛍光測定です。それぞれ対応したマイクロプレートリーダー等をご利用下さい。

２．測定範囲

　　Kit-CⅡは10～100μmol/L のNO2–/NO3–濃度の測定に、Kit-FXは1～10μmol/L のNO2–/NO3–濃度の測定に適しています。

３．阻害物質

　　フェノールレッドを含む培地は、Kit-CⅡでは使用可能ですが、Kit-FXでは使用できません。

Q

サンプルの前処理方法を教えて下さい。

A

＜血清＞
除蛋白が必要です。
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane ([UFC801008], Millipore 社) などで除タンパク（例えば7000 xg, 20 min, 4℃） して
測定試料として下さい。

トリクロロ酢酸を用いた除タンパクでも結構です。ただし、酸で除タンパクした場合は、測定前に必ずpHを中性に戻してから使用して下さい。
酵素反応が阻害をうける可能性があります。

＜尿＞
除蛋白が必要です。血清の除蛋白操作を参考に、除蛋白操作を行って下さい。

＜細胞培養液＞
遠心分離（例えば1000g, 15min, 室温)し、上澄みをサンプルとして下さい。
血清を添加している場合は、除蛋白を行って下さい。
血清のタンパク成分の影響で、NO2–/NO3–濃度が低く出る可能性があります。

＜組織＞　（例：マウス皮膚）
マウス皮膚をホモジナイズ遠心後（例えば、7,740 x g）の上澄みをUltrafree-MC centrifuge device(UFC3; Millipore社)などで除タンパクして測定試料としてください。

※組織前処理の参考文献：K. Nakai, et al., "Free radical production requires both inducible nitric oxide synthase and xanthine oxidase in LPS-treated skin", 
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006, 103(12), 4616-4621.

Q

金属による測定への影響

A

金属によっては影響します。

Fe(2価および3価)は0.1mmol/L くらいから蛍光強度の減少が見られます。
金属に対して等量か過剰のEDTAを加えることで影響を回避することができます。

その他の金属(Cu,Zn,Mg,Ca) は1 mmol/L まで影響が見られません。

Q

使用できない培地は何でしょう？

A

硝酸塩が多く含まれる培地は使用出来ません（RPMI1640など）その他、フェノールレッド、出来れば血清も、含まない培地をご使用ください。

＊注：[NO2–]のみの測定であれば可能ですが、[NO2–/NO3–]のトータルの濃度測定は出来ません。

＜硝酸塩＞

　Kit-FXの場合、1～10 μmol/L のNO2/NO3濃度の測定に適しています。
　例えば、RPMI 1640の場合、NO3が800 μmol/L 添加されていますので、測定限界をはるかに超えています。

　代表的な培地ですと
　『MEM』大部分の種類のものが硝酸を含んでおりませんので、硝酸を含んでいないものをお使いください。

　いずれの培地にしろ（勿論RPMI 1640は除きますが）、やむを得ず硝酸を含んだものをお使いになり、その影響が気になる場合は、サンプルに含まれる量と同量の培地のみで測定してブランクとして差し引いてください。
　培地のカタログに組成表が記載してありますので、測定前にご確認ください。

＜フェノールレッド＞
　反応の最後に[Stop solution]を添加しますが、これはアルカリ性溶液になっています。(蛍光を発するため)フェノールレッドが含まれていると[Stop solution]を添加後、培地が黒くなり蛍光が測定できません。

＜血清＞
　血清の中には元々、NO2/NO3が含まれております。
　そのため、血清を含む培地の場合には、培地を緩衝液で『希釈』していただく必要が生じます。

Q

試料を、前処理前に保存することはできますか？

A

-20℃で保管していただければ、保存は可能です。
-20℃で保管した血清は、凍結前と２ヶ月間凍結した後で、データに差がないことを確認しております。

しかし、試料中にNOxを分解するような物質（微生物など）が含まれると安定性が確保できませんので、ご注意下さい。

Q

測定を阻害する物質は、どのようなものがありますか？

A

硝酸塩が多く含まれる培地（RPM 1640など)中では、測定ができません。
詳しくは「使用できない培地は何でしょう？」のQ&Aをご参照下さい。

タンパク質や金属（Fe, Cu, Zn, Ca, Mgなど）が入っていると測定に影響が出ます。

試料は前処理の段階で、除タンパク操作を行って下さい。

金属はキレート剤（EDTAなど)を加えることで影響を回避できます。

詳しくは「金属による測定の影響」のQ&Aをご参照下さい。

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取扱条件

取扱条件
1.保存方法：冷蔵
危険・有害
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