上海金畔生物科技有限公司代理Takara酶试剂盒全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息。
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| ■ 制品内容 (5 次量) |
| PrimeScript RTase(200 U/μl) |
5 μl |
| RNase Inhibitor (40 U/μl) |
5 μl |
| Oligo(dT)18 Anchor Primer (1 μg /μl)*1 |
10 μl |
| 5×1st Strand Synthesis Buffer*2 |
20 μl |
| 1st Strand dNTP Mixture |
6 μl |
| E.coli RNase H/E.coli DNA Ligase Mixture |
10 μl |
| E.coli DNA Polymerase I (20 U/μl) |
10 μl |
| 2nd Strand dNTP Mixture |
23 μl |
| 5×2nd Strand Synthesis Buffer*2 |
150 μl |
| T4 DNA Polymerase (1 U/μl) |
20 μl |
| 10×T4 DNA Ligase Buffer |
20 μl |
| T4 DNA Ligase (350 U/μl) |
20 μl |
| EcoR I-Sma I Adaptor (0.4 μg/μl) |
18 μl |
| Not I Supplement |
135 μl |
| Not I (50 U/μl) |
15 μl |
| tRNA (10 μg/μl) |
5 μl |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier (4℃保存)*3 |
60 μl |
| 3 M Sodium Acetate (pH5.2) (4℃保存) |
1 ml |
| pAP3neo Predigested Vector (100 ng/μl)*4 |
5 μl |
| RNase-free H2O |
640 μl |
| Control RNA (1 μg/μl)*5 |
5 μl |
| T7 Promoter Primer (5 pmol/μl)*6 |
20 μl |
| T3 Promoter Primer (for pAP3neo) (5 pmol/μl)*6 |
20 μl |
| Spin Column (CHROMA SPIN™-1000＋DEPC-H2O Columns*7) (4℃保存) |
5 支 |
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| *1 Oligo(dT)18 Anchor Primer中含有Not I Site及Xho I Site。如果不用Not I 而用Xho I 进行酶切时，也可以制备EcoR I-Xho I 双链cDNA片段构建cDNA文库，利用这些Site的载体 (不可去磷酸化) 也可用来构建cDNA文库。另外，本试剂盒中不含有Xho I 酶，需要时请另外购买。 |
| *2 与PrimeScript Double Strand cDNA Synthesis Kit[Code No.: 6111A] 中所含有的组份不同。 |
| *3 同Dr. GenTLE Precipitation Carrier (Code No.: 9094)。 |
| *4 经EcoR I、Not I 酶切处理。 |
| *5 本试剂盒中的Control RNA是以pSPTet3质粒 (质粒中的SP6启动子下游插入长约1.4 kb的pBR322来源的DNA片段，该DNA片段上含有抗四环素基因) 为模板，由SP6 RNA聚合酶经体外转录而得到的，Control RNA (约1.4 kb )的3’端具有30 个A碱基的Poly(A)+尾。以这种RNA为模板合成的双链cDNA插入到适当的质粒载体中后，如果插入的cDNA确实为全长，那这种质粒便可获得四环素抗性。 |
| *6 可用于Insert Check及DNA测序。 |
*7 Clontech Laboratories公司产品。 (带下盖)
(注) 本制品不含对电转化法十分重要的大肠杆菌。使用本制品时，需用大肠杆菌的感受态细胞转化甲基化DNA。可采用E. coli HST08 Premium Electro-Cells (Code No.: 9028)、Clontech的Stellar™ Electrocompetent Cells (Clontech Code: 636756) |
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| ■ 制品说明 |
利用真核生物的各种组织或细胞中的Poly(A)+RNA合成cDNA，然后进行基因克隆，这在分子生物学实验中被广泛应用。这一技术的使用，使基因的结构解析及目的蛋白的表达等变得更为方便。
一般合成cDNA以及构建cDNA Library的方法为： ① 合成与目的Poly(A)+RNA相互补的双链cDNA；② 将双链cDNA与细菌或病毒来源的载体进行重组； ③ 将重组体导入细菌或真核细胞内进行扩增，构建cDNA Library。构建成的cDNA Library可以用于cDNA的解析，或者进一步进行体外转录或体外翻译等。
本试剂盒原理采用了Gubler-Hoffman法 (Linker Primer法)，是一种可以控制克隆基因方向性的Directional Cloning法，其原理见下图，具体说明如下：
1. 利用反转录酶PrimeScript RTase和Oligo(dT)18 Anchor Primer1,3-5)合成1st Strand cDNA。1st Strand cDNA合成时使用5-methyl dCTP。
2. E.coli RNase H使mRNA-1st Strand cDNA杂合体中的RNA形成Nick，再使用E.coli DNA Ploymerase和E.coli DNA Ligase将RNA链置换成DNA链，合成2nd Strand cDNA。
3. 使用T4 DNA Polymerase将双链cDNA末端平滑化。
4. 与Adaptor连接后，使用Not I 进行酶切。
5. 使用Spin Column除去短链cDNA。
6. 与Vector pAP3neo进行连接 (Directional Cloning)。
7. 利用电刺激转化法导入大肠杆菌。
8. 确认克隆效率及插入片段大小等。 |
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| ■ cDNA Library合成原理图 |
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| ■ 保存 |
Dr. GenTLE Precipitation Carrier 4℃保存。
3 M Sodium Acetate (pH5.2) 4℃保存。
Spin Column 4℃保存。
其他组份 -20℃保存。 |
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页面更新：2017-04-07 10:29:07
