Controllable NOdonor<NO-Rosa5>
在任意范围、时间通过可视光照射释放NO的试剂
Controllable NOdonor<NO-Rosa5>是通过黄绿色可视光（530~590 nm）的照射释放出一氧化氮（Nitric oxide，NO）的Photo-controllable NO donor。利用光毒性低的可视光照射可以在时间空间上控制NO的释放，有利于各种细胞内信号传输相关的NO生理现象研究。
※本产品仅供科研使用。
※本产品基于名古屋市立大学的中川秀彦教授的研究成果商品化而成。
◆Memo
关于NO研究中Photo-controllable NO donor的意义及问题点
虽然一氧化氮是分子量仅有30的气体分子，但是在生物体内作为信号传输物质而发挥作用，因此阐明其生理意义是一项重要的课题。下文阐述了一些与NO研究相关的生理现象。
● 血管舒张（vasodilation）
● 神经传输（neurotransmission）
● 血小板黏附（platelet adhesion）
● 炎症反应（inflammation）
NO的气体分子是通过生物体内的NO合成酶产生，但在生理条件下极其不稳定，半衰期约为几秒左右。因此，NO被认为是在生物体内产生后，仅在非常狭小的范围（<100 μm）内起作用的局部信号传输物质，因此，期待能够阐明NO作为媒介参与的局部信号传输的意义。然而，由于NO是不稳定的气体分子，难以用于实验中，于是NO donor便被用于验证NO生理效果。
NO donor是在水溶液中分解，并缓慢释放NO的化合物群的总称。不同NO释放效率以及半衰期各异的化合物被开发成各种产品。然而，使用以前的NO释放剂，会使实验溶液全部均一地释放出NO，导致很难观察到原来的NO作用于局部的瞬时效果。为了解决该问题，近年来已开发出几种光反应性的NO donor如“Photo-controllable NO donor”，1） 需要UV光的试剂类，或2） 主要使用金属络合物的试剂类，但无论哪种都有难以适用于活细胞实验的缺点（参照表格）。
名古屋市立大学的中川秀彦教授等人克服了至今的问题，成功开发出不含金属络合物，毒性低且能在时间空间上控制NO释放，并通过可视光控制的Photo-controllable NO donor——NO-Rosa5（Controllable NOdonor）。使用本产品，可以在任意时间以及任意局部控制NO释放，作为研究NO的新工具而备受期待。
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普通NO donor
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Photo-controllable NO donor
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UV光控型
CNO-4,BNN5等
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金属络合物
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Controllable Nodonor
（NO-Rosa5）
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NO释放原理
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自发性分解
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光分解后自发分解
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光分解
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光分解
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光照
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——
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UV光
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可视光、近红外光
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可视光
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（~300 nm）
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（530~590 nm）
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时间控制
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困难
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可以
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可以
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可以
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空间控制
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不可以
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可以
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可以
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可以
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光毒性
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——
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毒性极高
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毒性低
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毒性低
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化合物的细胞毒性
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与化合物有关
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低
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高
（金属毒性）
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低
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◆参考文献
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1.
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Ieda, et al., Sci. Rep., 9, 1430, (2019) ,"Structure-efficiency relationship of photoinduced electron transfer-triggered nitric oxide releasers."
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2.
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Ieda, et al., Chem. Pharm. Bull., 67, 576～579 (2019), "In cellullo and ex vivo availability of yellowish-green-light-controllable NO releaser."
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3.
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Okuno, et al., Org. Biomol. Chem., 15, 2791～2796 (2017), "A yellowish-green-light-controllable nitric oxide donor based on N-nitrosoaminophenol applicable for photocontrolled vasodilation."
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◆原理
本试剂将Rosamine色素骨架用作光吸收天线，在吸收黄绿色光（530~590 nm）时，诱导光致电子转移(PeT: Photoinduced electron Transfer)，释放出NO。
◆特点
● 通过黄绿色光（530~590 nm；最大吸收λmax～560 nm）引发NO释放。
● 非光照射时，NO释放量被抑制在极其微小的程度*1 。
● 推荐使用浓度10 μM，未发现细胞毒性。
● 已验证了在培养细胞系，ex vivo主动脉血管舒张实验中的生物活性。
● 已证实显微镜的543 nm射线（He- Ne射线）以及氙灯可作为光源使用。
*1 请务必注意实验中的环境光线。
◆操作方法概要
※以下实验步骤仅供参考。请根据具体实验目的进行探讨。
1. 制备含有Controllable NOdonor的培养基
2. 去除培养基
3. 更换含有Controllable NOdonor的培养基*2
4. 培养30分钟以上
5. 在任意时间、部位进行光照，然后进行各种成像*3 或生化学分析
*2 也可不更换培养基，直接添加Controllable NOdonor。
*3 各种成像中使用荧光物质作为检测系统时，需要注意荧光物质的选择。详见下文中的“实验指导”。
实验注意
本产品有可能因实验环境的光线（室内荧光灯或阳光）分解，释放出NO。在制备溶液以及进行实验时尽量保持避光。
◆应用实例
■ 通过NO电极定量NO释放活性
作为in vivo NO释放模型，用黄绿色光（530~590 nm带通滤波器）照射含10 μM Controllable NOdonor、100 mM HEPES（pH7.3）、0.1% DMSO的溶液，通过NO电极定量释放的游离NO浓度。连续300秒照射时，最大可观察到4 μM的NO（左）。照射时间每20秒脉冲一次时，则可观察到阶段性的NO释放。随着试剂消耗，NO的释放量也逐渐减少（右）。
■ 使用NO检测试剂实现NO释放活性可视化
用绿色荧光NO检测试剂DAF-FM（10 μM）前处理HEK293T细胞30分钟后，用PBS清洗细胞，在添加Controllable NOdonor的条件下培养30分钟。使用NO检测试剂DAF-FM的荧光强度观察氙气光源（带通滤波器 530~590 nm）照射前后细胞内的NO量。由于光照后DAF-FM的荧光强度显著增强，可以看出通过光照促使NO释放。
■ 通过局部的光照使特定部位释放NO
用荧光NO检测试剂DAF-FM DA（10 μM）前处理HEK293T细胞30分钟后，用PBS清洗细胞，在添加Controllable NOdonor的条件下培养60分钟。使用共聚焦显微镜的543 nm射线光照白圈部分（直径31 μm），通过DAF-FM检测NO的释放。可以确认仅白圈部分释放出NO。使用本试剂，可通过光在时间空间上控制NO的释放。
■ ex vivo 血管舒张实验
将分离的大鼠主动脉切片浸于填满Krebs缓冲液的Magnus 试管中，并添加抑制内源性NO产生的NO合成酶抑制剂L-NAME（100 μM）。接着，添加去甲肾上腺素（10 μM）使血管进入收缩状态。即使用绿光（530~590 nm）照射3分钟，也未发现光自身对血管收缩有效果（图中①）。但添加Controllable NOdonor（10 μM）后照射绿光则可观察到明显的血管舒张（图中②④）。停止光照后，再次发现血管收缩（图中③⑤）。虽然sGC（soluble guanylyl cyclase）-cGMP路径参与NO引起的血管舒张，但在该状态下添加sGC抑制剂ODQ（10 μM）的话，绿光照射也能抑制血管扩张（图中⑥）。实验结果可以看出使用Controllable NOdonor通过光照能够控制血管舒张。
■ 评价细胞毒性
向HEK293T细胞中分别添加10（推荐浓度）、30、100 μM的Controllable NOdonor并培养48小时后，使用WST-8分析评价细胞存活率。30 μM以下的细胞存活率得以维持，但在高浓度的100 μM中发现了细胞毒性。本试剂推荐使用10 μM。
◆实验指导
光谱信息
Controllable NOdonor拥有下图所示的吸收和荧光光谱。530~590 nm的光照可以有效地释放出NO。另外，由于含有Rosamine骨架，请注意在500~600 nm的光照下激发，会观察到红色荧光。
荧光染料选择指导
由于Controllable NOdonor在500~600 nm光照下会释放NO，在实验中同时使用荧光物质（荧光色素，荧光检测试剂，荧光蛋白等）时，请务必注意以下几点。建议提前探讨Controllable NOdonor的荧光特性是否会影响目的荧光物质的观察。
（1）避免使用红色荧光物质
原因如下，在500~600 nm范围内不推荐使用含有激发波长的红色荧光物质。
1. 通过激发光的照射，诱导Controllable NOdonor的NO释放。
2. 观察到Controllable NOdonor的Rosamine骨架来源的荧光。
（2）可同时使用的荧光物质
以下波长范围的荧光物质可以与Controllable NOdonor同时使用。
激发波长<500 nm的荧光物质（蓝色荧光物质或绿色荧光物质等）
激发波长>600 nm的近红外荧光物质
※确认NO的释放推荐使用绿色荧光NO检测试剂DAF-FM DA
※ 本页面产品仅供研究用，研究以外不可使用。
