样品分析方案 

储备溶液配制

操作步骤

参考文献

A novel tracer for in vivo optical imaging of fatty acid metabolism in the heart and brown adipose tissue.
Authors: Panagia, Marcello and Yang, Jing and Gale, Eric and Wang, Huan and Luptak, Ivan and Chen, Howard H and Patel, Dakshesh and Croteau, Dominique and Pimentel, David Richard and Bachschmid, Markus Michael and Colucci, Wilson S and Ran, Chongzhao and Sosnovik, David E
Journal: Scientific reports (2020): 11209

A novel two-photon ratiometric fluorescent probe for imaging and sensing of BACE1 in different regions of AD mouse brain.
Authors: Ge, Lihong and Liu, Zhichao and Tian, Yang
Journal: Chemical science (2020): 2215-2224

CD24-targeted fluorescence imaging in patient-derived xenograft models of high-grade serous ovarian carcinoma.
Authors: Kleinmanns, Katrin and Bischof, Katharina and Anandan, Shamundeeswari and Popa, Mihaela and Akslen, Lars A and Fosse, Vibeke and Karlsen, Ida Tveit and Gjertsen, Bjørn T and Bjørge, Line and McCormack, Emmet
Journal: EBioMedicine (2020): 102782

Challenging a Preconception: Optoacoustic Spectrum Differs from the Optical Absorption Spectrum of Proteins and Dyes for Molecular Imaging.
Authors: Fuenzalida Werner, Juan Pablo and Huang, Yuanhui and Mishra, Kanuj and Janowski, Robert and Vetschera, Paul and Heichler, Christina and Chmyrov, Andriy and Neufert, Clemens and Niessing, Dierk and Ntziachristos, Vasilis and Stiel, Andre C
Journal: Analytical chemistry (2020)

Identification and local manipulation of bone marrow vasculature during intravital imaging.
Authors: Morikawa, Takayuki and Tamaki, Shinpei and Fujita, Shinya and Suematsu, Makoto and Takubo, Keiyo
Journal: Scientific reports (2020): 6422

Nanobody click chemistry for convenient site-specific fluorescent labelling, single step immunocytochemistry and delivery into living cells by photoporation and live cell imaging.
Authors: Hebbrecht, Tim and Liu, Jing and Zwaenepoel, Olivier and Boddin, Gaëlle and Van Leene, Chloé and Decoene, Klaas and Madder, Annemieke and Braeckmans, Kevin and Gettemans, Jan
Journal: New biotechnology (2020): 33-43

Near-Infrared In Vivo Whole-Body Fluorescence Imaging of PNA.
Authors: Lim, Ernest Wee Kiat and Brolin, Camilla and Nielsen, Peter E
Journal: Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) (2020): 251-260

Noninvasive In Situ Ratiometric Imaging of Biometals Based on Self-Assembled Peptide Nanoribbon.
Authors: Lei, Li and Li, Min and Wu, Sufen and Xu, Zhiai and Geng, Ping and Tian, Yang and Fu, Ying and Zhang, Wen
Journal: Analytical chemistry (2020): 5838-5845

Preliminary study on the application of en bloc resection combined with near-infrared molecular imaging technique in the diagnosis and treatment of bladder cancer.
Authors: Yang, Yongjun and Yang, Xiaofeng and Liu, Chao and Li, Jiawei
Journal: World journal of urology (2020)

Real-time in vivo imaging of extracellular ATP in the brain with a hybrid-type fluorescent sensor.
Authors: Kitajima, Nami and Takikawa, Kenji and Sekiya, Hiroshi and Satoh, Kaname and Asanuma, Daisuke and Sakamoto, Hirokazu and Takahashi, Shodai and Hanaoka, Kenjiro and Urano, Yasuteru and Namiki, Shigeyuki and Iino, Masamitsu and Hirose, Kenzo
Journal: eLife (2020)

染色样本分析

操作步骤

1.准备蛋白质储备溶液（溶液A）：

将100μL反应缓冲液（如1 M碳酸钠溶液或1 M磷酸盐缓冲液，pH~9.0）与900μL目标蛋白溶液（如抗体，蛋白质浓度> 2 mg / ml，如果可能）混合至100μL，再加入1 mL蛋白质标记原液。

注1：蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH低于8.0，则使用1M碳酸氢钠溶液或1M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH调节至8.0-9.0的范围。

注2：蛋白质应溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（例如硫酸铵和乙酸铵）。

注3：不纯的抗体、稳定的牛血清蛋白（BSA）抗体或明胶不会被很好的标记，叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰缀合反应。可以通过透析或旋转柱除去叠氮化钠或硫柳汞，以获得极佳标记结果。

注4：如果蛋白质浓度低于2 mg / mL，则结合效率会显着降低。为获得极佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为2-10 mg / mL。

2.准备染料储备溶液（溶液B）：

将无水DMSO加入到iFluor 染料SE小瓶中以制备10-20mM储备溶液。 通过移液或涡旋混合均匀。

注意：在开始缀合前准备染料储备溶液（溶液B），及时使用。 染料储备溶液的长期储存可降低染料活性。 溶液B可在冰箱中保存两周，避光保存。 避免冻融循环。

3.确定最佳染料/蛋白质比例（可选）：

注意：每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能影响其结合亲和力，而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。我们建议您通过使用连续不同量的标记染料溶液重复步骤4和5来实验确定最佳染料/蛋白质比率。通常，对于大多数染料 – 蛋白质缀合物，推荐使用4-6种染料/蛋白质。

3.1使用10：1摩尔比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）作为起始点：将5μl染料储备溶液（溶液B，假设染料储备溶液为10 mM）加入到样品瓶中。蛋白质溶液（95μl溶液A）有效摇动。假设蛋白质浓度为10mg / mL并且蛋白质的分子量为~200KD，蛋白质的浓度为~0.05mM。

注意：蛋白质溶液中DMSO的浓度应<10％。

3.2运行缀合反应（参见下面的步骤4）。

3.3重复＃3.2，溶液B /溶液A的摩尔比为5：1;分别为15：1和20：1。

3.4使用预制的旋转柱纯化所需的缀合物。

3.5计算上述4种结合物的染料/蛋白质比（DOS）。

3.6检测上述4种结合物，确定最佳的染料/蛋白质比例，以扩大标记反应。

4.运行结合反应：

4.1有效加入适量的染料储备溶液（溶液B）到蛋白质溶液（溶液A）的小瓶中晃动。

注意：溶液B /溶液的最佳摩尔比由步骤3.6确定。如果跳过步骤3，我们建议使用10：1溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的摩尔比。

4.2继续在室温下旋转或摇动反应混合物30-60分钟。

5.纯化缀合物

以下方案是使用Sephadex G-25柱纯化染料 – 蛋白质缀合物的实例。

5.1按照说明书准备Sephadex G-25色谱柱。

5.2将反应混合物（直接从步骤4）加载到Sephadex G-25柱的顶部。

5.3样品在顶部树脂表面下方运行时立即加入PBS（pH 7.2-7.4）。

5.4向所需样品中加入更多PBS（pH 7.2-7.4）以完成色谱柱纯化。

注1：立即使用时，染料 – 蛋白质偶联物需要用染色缓冲液稀释，并等分多次使用。

注2：对于长期储存，染料 – 蛋白质缀合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

图示

图1.将HeLa细胞与（Tubulin +）或（Tubulin-）小鼠抗微管蛋白一起孵育，然后与iFluor 488山羊抗小鼠IgG缀合物（绿色，左）和AlexaFluor®488山羊抗小鼠IgG缀合物（绿色）一起孵育，右）。细胞核用Hoechst 33342（蓝色）染色。

图2.人淋巴细胞上AlexaFluor®488和iFluor 488抗人CD4的流式细胞仪分析。在每个测试中，PBMC细胞都用0.5 ug 488抗人CD4和0.5 ug iFluor 488抗人CD4染色。在ACEA流式细胞仪系统上进行流式细胞仪分析。

图3. HeLa细胞先用兔抗微管蛋白染色，再用iFluor 488山羊抗兔IgG（H + L）染色，细胞核用nuclear red DCS1染色。

试剂应用文献

RIM and RIM-BP form presynaptic active-zone-like condensates via phase separation

Authors: Wu, Xiandeng and Cai, Qixu and Shen, Zeyu and Chen, Xudong and Zeng, Menglong and Du, Shengwang and Zhang, Mingjie
Journal: Molecular cell (2019): 971–984

Basal condensation of Numb and Pon complex via phase transition during Drosophila neuroblast asymmetric division
Authors: Shan, Zelin and Tu, Yuting and Yang, Ying and Liu, Ziheng and Zeng, Menglong and Xu, Huisha and Long, Jiafu and Zhang, Mingjie and Cai, Yu and Wen, Wenyu
Journal: Nature Communications (2018): 737

参考文献

Deep Sequencing Analysis of the Eha-Regulated Transcriptome of Edwardsiella tarda Following Acidification
Authors: D Gao, N Liu, Y Li, Y Zhang, G Liu
Journal: Metabolomics (Los Angel) (2017): 2153–0769

Suramin inhibits cullin-RING E3 ubiquitin ligases
Authors: Kenneth Wu, Robert A Chong, Qing Yu, Jin Bai, Donald E Spratt, Kevin Ching, Chan Lee, Haibin Miao, Inger Tappin, Jerard Hurwitz
Journal: Proceedings of the National Academy of Sciences (2016): E2011–E2018

Glycosaminoglycan mimicry by COAM reduces melanoma growth through chemokine induction and function
Authors: Helene Piccard, Nele Berghmans, Eva Korpos, Chris Dillen, Ilse Van Aelst, Sandra Li, Erik Martens, Sandra Liekens, Sam Noppen, Jo Van Damme
Journal: International Journal of Cancer (2012): E425–E436

相关产品

染色样本分析

操作步骤

1.准备蛋白质储备溶液（溶液A）：

将100μL反应缓冲液（如1 M碳酸钠溶液或1 M磷酸盐缓冲液，pH~9.0）与900μL目标蛋白溶液（如抗体，蛋白质浓度> 2 mg / ml，如果可能）混合至100μL，再加入1 mL蛋白质标记原液。

注1：蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH低于8.0，则使用1M碳酸氢钠溶液或1M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH调节至8.0-9.0的范围。

注2：蛋白质应溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（例如硫酸铵和乙酸铵）。

注3：不纯的抗体、稳定的牛血清蛋白（BSA）抗体或明胶不会被很好的标记，叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰缀合反应。可以通过透析或旋转柱除去叠氮化钠或硫柳汞，以获得极佳标记结果。

注4：如果蛋白质浓度低于2 mg / mL，则结合效率会显着降低。为获得极佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为2-10 mg / mL。

2.准备染料储备溶液（溶液B）：

将无水DMSO加入到iFluor 染料SE小瓶中以制备10-20mM储备溶液。 通过移液或涡旋混合均匀。

注意：在开始缀合前准备染料储备溶液（溶液B），及时使用。 染料储备溶液的长期储存可降低染料活性。 溶液B可在冰箱中保存两周，避光保存。 避免冻融循环。

3.确定最佳染料/蛋白质比例（可选）：

注意：每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能影响其结合亲和力，而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。我们建议您通过使用连续不同量的标记染料溶液重复步骤4和5来实验确定最佳染料/蛋白质比率。通常，对于大多数染料 – 蛋白质缀合物，推荐使用4-6种染料/蛋白质。

3.1使用10：1摩尔比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）作为起始点：将5μl染料储备溶液（溶液B，假设染料储备溶液为10 mM）加入到样品瓶中。蛋白质溶液（95μl溶液A）有效摇动。假设蛋白质浓度为10mg / mL并且蛋白质的分子量为~200KD，蛋白质的浓度为~0.05mM。

注意：蛋白质溶液中DMSO的浓度应<10％。

3.2运行缀合反应（参见下面的步骤4）。

3.3重复＃3.2，溶液B /溶液A的摩尔比为5：1;分别为15：1和20：1。

3.4使用预制的旋转柱纯化所需的缀合物。

3.5计算上述4种结合物的染料/蛋白质比（DOS）。

3.6检测上述4种结合物，确定最佳的染料/蛋白质比例，以扩大标记反应。

4.运行结合反应：

4.1有效加入适量的染料储备溶液（溶液B）到蛋白质溶液（溶液A）的小瓶中晃动。

注意：溶液B /溶液的最佳摩尔比由步骤3.6确定。如果跳过步骤3，我们建议使用10：1溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的摩尔比。

4.2继续在室温下旋转或摇动反应混合物30-60分钟。

5.纯化缀合物

以下方案是使用Sephadex G-25柱纯化染料 – 蛋白质缀合物的实例。

5.1按照说明书准备Sephadex G-25色谱柱。

5.2将反应混合物（直接从步骤4）加载到Sephadex G-25柱的顶部。

5.3样品在顶部树脂表面下方运行时立即加入PBS（pH 7.2-7.4）。

5.4向所需样品中加入更多PBS（pH 7.2-7.4）以完成色谱柱纯化。

注1：立即使用时，染料 – 蛋白质偶联物需要用染色缓冲液稀释，并等分多次使用。

注2：对于长期储存，染料 – 蛋白质缀合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

图示

图1.将HeLa细胞与（Tubulin +）或（Tubulin-）小鼠抗微管蛋白一起孵育，然后与iFluor 488山羊抗小鼠IgG缀合物（绿色，左）和AlexaFluor®488山羊抗小鼠IgG缀合物（绿色）一起孵育，右）。细胞核用Hoechst 33342（蓝色）染色。

图2.人淋巴细胞上AlexaFluor®488和iFluor 488抗人CD4的流式细胞仪分析。在每个测试中，PBMC细胞都用0.5 ug 488抗人CD4和0.5 ug iFluor 488抗人CD4染色。在ACEA流式细胞仪系统上进行流式细胞仪分析。

图3. HeLa细胞先用兔抗微管蛋白染色，再用iFluor 488山羊抗兔IgG（H + L）染色，细胞核用nuclear red DCS1染色。

试剂应用文献

RIM and RIM-BP form presynaptic active-zone-like condensates via phase separation

Authors: Wu, Xiandeng and Cai, Qixu and Shen, Zeyu and Chen, Xudong and Zeng, Menglong and Du, Shengwang and Zhang, Mingjie
Journal: Molecular cell (2019): 971–984

Basal condensation of Numb and Pon complex via phase transition during Drosophila neuroblast asymmetric division
Authors: Shan, Zelin and Tu, Yuting and Yang, Ying and Liu, Ziheng and Zeng, Menglong and Xu, Huisha and Long, Jiafu and Zhang, Mingjie and Cai, Yu and Wen, Wenyu
Journal: Nature Communications (2018): 737

参考文献

Deep Sequencing Analysis of the Eha-Regulated Transcriptome of Edwardsiella tarda Following Acidification
Authors: D Gao, N Liu, Y Li, Y Zhang, G Liu
Journal: Metabolomics (Los Angel) (2017): 2153–0769

Suramin inhibits cullin-RING E3 ubiquitin ligases
Authors: Kenneth Wu, Robert A Chong, Qing Yu, Jin Bai, Donald E Spratt, Kevin Ching, Chan Lee, Haibin Miao, Inger Tappin, Jerard Hurwitz
Journal: Proceedings of the National Academy of Sciences (2016): E2011–E2018

Glycosaminoglycan mimicry by COAM reduces melanoma growth through chemokine induction and function
Authors: Helene Piccard, Nele Berghmans, Eva Korpos, Chris Dillen, Ilse Van Aelst, Sandra Li, Erik Martens, Sandra Liekens, Sam Noppen, Jo Van Damme
Journal: International Journal of Cancer (2012): E425–E436

相关产品