Amplite 荧光法过氧化氢检测试剂盒 近红外荧光

简要概述

Amplite 荧光法过氧化氢检测试剂盒 近红外荧光 是美国AAT Bioquest生产的用于检测过氧化氢的试剂盒，过氧化氢（H₂O₂）是一种活性氧代谢副产物，可作为许多氧化应激相关状态的关键调节剂。它涉及许多与哮喘，动脉粥样硬化，糖尿病血管病变，骨质疏松症，一些神经退行性疾病和唐氏综合症有关的生物学事件。也许H₂O₂生物学最有趣的方面是最近的报告，即抗体具有将分子氧转化为过氧化氢的能力，有助于免疫系统的正常识别和破坏过程。测量这种活性物质将有助于确定氧化应激如何调节各种细胞内途径。

这种Amplite 荧光过氧化氢测定试剂盒使用我们的非荧光Amplite 红色过氧化物酶底物来量化溶液和细胞提取物中的过氧化氢。它还可用于通过酶偶联反应检测多种氧化酶活性。该试剂盒是一种优化的“混合和读数”分析，与HTS液体处理仪器兼容。它提供灵敏的一步荧光测定法，可在100μL测定体积（30 nM，图1）中检测少至3皮摩尔的H₂O₂。该测定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行，并且易于适应自动化。 其信号可通过Ex / Em = ~540 / 590 nm的荧光酶标仪或~570 nm的吸光度酶标仪轻松读取。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供最优质的Amplite 荧光法过氧化氢检测试剂盒。

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产品说明书

96孔板的测定方案

概述

准备H₂O₂反应混合物（50μL）

加入H₂O₂标准品或测试样品（50μL）

在室温下孵育10-30分钟在Ex / Em = 540/590 nm处监测荧光强度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻所有试剂盒组分。

操作方法

1.准备库存解决方案：

1.1100X Amplite 红色过氧化物酶底物原液：将250μLDMSO（组分E）加入到Amplite 红色底物（组分A）的小瓶中。 应及时使用原液; 任何剩余的溶液应等分并在-20℃重新冷冻。

注意：避免反复冻融循环并避免光照。

1.220U / mL过氧化物酶储备溶液：将1mL测定缓冲液（组分C）加入到辣根过氧化物酶（组分D）的小瓶中。

注意：未使用的HRP溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20 ℃。

1.320mM H₂O₂储备溶液：将22.7L的3％H₂O₂（0.88M，组分B）加入977L的测定缓冲液（组分C）中。

注意：稀释的H₂O₂溶液不稳定。 应丢弃未使用的部分。

2.准备H₂O₂反应混合物：

3.准备H₂O₂标准品（0至10μM）的连续稀释液：

注意1：在存硫醇如DTT和β-巯基乙醇的情况下，组分A不稳定。 高于10M（最终浓度）的硫醇将显着降低测定动态范围。

注意2：NADH和谷胱甘肽（还原形式：GSH）可能会干扰检测。

3.1将1μL20mM H₂O₂溶液（来自步骤1.3）加入1999μL测定缓冲液（组分C）中，得到10μMH₂O₂标准品。

3.2取200μL10μMH₂O₂标准品进行1：3连续稀释，得到3，1,0.3,0.1,0.03,0.01和0μMH₂O₂标准品系列稀释液。

3.3如说明书中表2和3中所述，将H₂O₂标准品和含H₂O₂的测试样品的系列稀释液加入到固体黑色96孔微量培养板中。

4.在上清液反应中进行H₂O₂测定：

4.1将50μLH₂O₂反应混合物（来自步骤2）加入到H₂O₂标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3），使总H₂O₂测定体积为100μL/孔。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLH₂O₂反应混合物。

4.2在室温下孵育反应15至30分钟，避光。

4.3在Ex / Em = 540±10/590±10nm（最佳Ex / Em = 540 / 590nm）下用荧光板读数器监测荧光增加。

注意：也可以将板的内容物转移到白色透明底板上，并用吸光度酶标仪在576±5nm的波长下读数。与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。

5.对细胞进行H₂O₂检测：

Amplite 荧光过氧化氢检测试剂盒可用于测量细胞中H₂O₂的释放。 以下是建议的协议，可以进行修改以满足特定的研究需求。

5.1 H2O2反应混合物应按步骤2制备，但分析缓冲液（组分C）应替换为细胞培养系统中使用的培养基。建议的培养基包括（a）Krebs Ringers磷酸盐缓冲液（KRPB）;（b）汉克斯平衡盐溶液（HBSS）; 或（c）无血清培养基。

5.2在96孔板（50-100μL/孔）中制备细胞，并根据需要激活细胞。

注意：包括阴性对照（单独培养基和非活化细胞）用于测量背景荧光。

5.3将50μLH₂O₂反应混合物（来自步骤5.1）加入到细胞和H₂O₂标准品的每个孔中（来自步骤3.3）

5.4在室温下孵育反应15至30分钟，避光。

5.5用Ex / Em = 540±10/590±10nm（最佳Ex / Em = 540 / 590nm）的荧光板读数器监测荧光增加。

参考文献

Bio-inspired redox-cycling antimicrobial film for sustained generation of reactive oxygen species
Authors: Huan Liu, Xue Qu, Eunkyoung Kim, Miao Lei, Kai Dai, Xiaoli Tan, Miao Xu, Jinyang Li, Yangping Liu, Xiaowen Shi
Journal: Biomaterials (2018)

PPARα-mediated peroxisome induction compensates PPARγ-deficiency in bronchiolar club cells
Authors: Srikanth Karnati, Gani Oruqaj, Harshavardhan Janga, Srinu Tumpara, Claudia Colasante, Paul P Van Veldhoven, Nancy Braverman, Adrian Pilatz, Thomas J Mariani, Eveline Baumgart-Vogt
Journal: PloS one (2018): e0203466

Semaphorin 4D inhibits neutrophil activation and is involved in the pathogenesis of neutrophil-mediated autoimmune vasculitis
Authors: Masayuki Nishide, Satoshi Nojima, Daisuke Ito, Hyota Takamatsu, Shohei Koyama, Sujin Kang, Tetsuya Kimura, Keiko Morimoto, Takashi Hosokawa, Yoshitomo Hayama
Journal: Annals of the Rheumatic Diseases (2017): annrheumdis–2016

Aggravation of brain infarction through an increase in acrolein production and a decrease in glutathione with aging
Authors: Takeshi Uemura, Kenta Watanabe, Misaki Ishibashi, Ryotaro Saiki, Kyoshiro Kuni, Kazuhiro Nishimura, Toshihiko Toida, Keiko Kashiwagi, Kazuei Igarashi
Journal: Biochemical and biophysical research communications (2016): 630–635

Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues
Authors: Lei Rong, Chi Zhang, Qi Lei, Ming-Ming Hu, Jun Feng, Hong-Bing Shu, Yi Liu, Xian-Zheng Zhang
Journal: Regenerative Biomaterials (2016): rbw022

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Authors: Cheng-Yu Chen, Cheng-Cheng Lee, Hung-Shuan Chen, Chao-Hsun Yang, Shu-Ping Wang, Jyh-Horng Wu, Menghsiao Meng
Journal: Process Biochemistry (2016): 1486–1495

Dopamine-mediated oxidation of methionine 127 in α-synuclein causes cytotoxicity and oligomerization of α-synuclein
Authors: Kazuhiro Nakaso, Naoko Tajima, Satoru Ito, Mari Teraoka, Atsushi Yamashita, Yosuke Horikoshi, Daisuke Kikuchi, Shinsuke Mochida, Kenji Nakashima, Tatsuya Matsura
Journal: PLoS One (2013): e55068

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Authors: He-Ping Ma
Journal: Journal of Biological Chemistry (2011): 32444–32453

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	货号	11505	存储条件	在零下15度以下保存, 避免光照
	规格	100 Tests	价格	3192
	Ex (nm)	405	Em (nm)	450
	分子量		溶剂
	产品详细介绍

简要概述

Cell Meter 细胞内荧光法过氧化氢检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于检测过氧化物的试剂盒，过氧化氢是一种活性氧代谢副产物，可作为许多氧化应激相关状态的关键调节剂。 它涉及许多与哮喘，动脉粥样硬化，糖尿病血管病变，骨质疏松症，许多神经退行性疾病和唐氏综合症有关的生物学事件。 这种活性物质的测量有助于确定氧化应激如何调节各种细胞内途径。 Cell Meter 细胞内荧光过氧化氢检测试剂盒使用我们独特的OxiVision Blue过氧化物来定量活细胞中的过氧化氢。 OxiVision 蓝色过氧化物具有细胞渗透性，当与过氧化氢反应时会产生蓝色荧光。 该试剂盒提供了一种监测活细胞中过氧化氢水平的敏感工具，并且它被优化用于流式细胞术。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供最优质的Cell Meter 细胞内荧光法过氧化氢检测试剂盒。 

活性氧（ROS）篇：包含总ROS和多种活性氧离子检测试剂大全

产品说明书

样品实验方案

简要概述

1.在生长培养基中制备细胞
2.用OxiVision 蓝色过氧化物传感器染色细胞
3.用测试化合物处理细胞
4.使用流式细胞仪Pacific Blue Channel监测荧光强度（Ex / Em = 405/450 nm）

溶液制备 

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
1. OxiVision 蓝色过氧化物传感器原液：
将100μLDMSO（组分B）加入到OxiVision 蓝色过氧化物传感器（组分A）的小瓶中，并充分混合。 注意：1μL重组的OxiVision 蓝色过氧化物传感器原液足以容纳0.5 mL细胞。 应立即使用原液,避光。

点击查看细胞制备指南

样品分析

1.用OxiVision 蓝色过氧化物传感器储备液在完全培养基或37°C所需缓冲液中染色细胞20-30分钟，避光。

2.用测试化合物在完全培养基或37℃的所需缓冲液中处理细胞一段所需的时间。对于对照样品（未处理的细胞），加入相应量的化合物缓冲液。注意：建议在完全培养基中处理细胞。然而，如果测试的化合物对血清敏感，则可以在治疗前吸出生长培养基和血清因子。在抽吸后，将细胞重悬于1X Hank盐溶液和20mM Hepes缓冲液（HHBS）或您选择的缓冲液中。或者，可以在无血清培养基中处理细胞。注意：我们用完全培养基中的100μM过氧化氢在37°C处理Jurkat细胞90分钟以诱导过氧化氢。详细信息请参见图1。

3.使用流式细胞仪监测太平洋蓝色通道（Ex / Em = 405 / 450nm）的荧光强度。

参考文献

Plasma-activated medium selectively eliminates undifferentiated human induced pluripotent stem cells
Authors: Ryo Matsumoto, Kazunori Shimizu, Takunori Nagashima, Hiromasa Tanaka, Masaaki Mizuno, Fumitaka Kikkawa, Masaru Hori, Hiroyuki Honda
Journal: Regenerative Therapy (2016): 55–63

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	Ex (nm)	498	Em (nm)	517
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简要概述

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活性氧（ROS）篇：包含总ROS和多种活性氧离子检测试剂大全

产品说明书

样品实验方案

简要概述

1.在生长培养基中制备细胞
2.使用OxiVision Green过氧化物染色细胞
3.用测试化合物处理细胞
4.用流式细胞仪FITC通道监测荧光强度（Ex / Em = 490/530 nm）

溶液制备 

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
1. OxiVision 绿色过氧化物传感器原液：
将100μLDMSO（组分B）加入到OxiVision 绿色过氧化物（组分A）的小瓶中，并充分混合。 注意：1μL重组的OxiVision 绿色过氧化物储备溶液适用于0.5 mL细胞。 应立即使用原液,避光。

点击查看细胞制备方案

样品分析

1.使用OxiVision 绿色过氧化物传感器储备溶液在完全培养基或37°C所需缓冲液中染色细胞30分钟，避光。

2.用测试化合物在完全培养基或37℃的所需缓冲液中处理细胞一段所需的时间。对于对照样品（未处理的细胞），加入相应量的化合物缓冲液。注意：建议在完全培养基中处理细胞。然而，如果测试的化合物对血清敏感，则可以在治疗前吸出生长培养基和血清因子。在抽吸后，将细胞重悬于1X Hank盐溶液和20mM Hepes缓冲液（HHBS）或您选择的缓冲液中。或者，可以在无血清培养基中处理细胞。注意：我们用完全培养基中的100μM过氧化氢在37°C处理Jurkat细胞90分钟以诱导过氧化氢。详细信息请参见图1。

3.用测试化合物在37℃处理细胞一段所需的时间。取出处理溶液，然后用OxiVision 绿色过氧化物传感器储备液在全培养基或37°C所需的缓冲液中染色细胞一段所需的时间。

4.使用流式细胞仪监测FITC通道（Ex / Em = 490 / 530nm）的荧光强度。

参考文献

Role of Polydopamine’s Redox-Activity on its Pro-oxidant, Radical-Scavenging, and Antimicrobial Activities
Authors: Huan Liu, Xue Qu, Haoqi Tan, Jialin Song, Miao Lei, Eunkyoung Kim, Gregory F Payne, Changsheng Liu
Journal: Acta Biomaterialia (2019)

Plasma-activated medium selectively eliminates undifferentiated human induced pluripotent stem cells
Authors: Ryo Matsumoto, Kazunori Shimizu, Takunori Nagashima, Hiromasa Tanaka, Masaaki Mizuno, Fumitaka Kikkawa, Masaru Hori, Hiroyuki Honda
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简要概述

Amplite 比色法过氧化酶检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于过氧化物酶的试剂盒，过氧化酶是常用于与抗体按4:1比例结合的小分子(MW ~40 KD)。由于分子量小，因此在与抗体、抗原结合形成复合物时不会带来空间阻碍。与其它酶标签相比，过氧化酶也更便宜；其主要缺点是在保护剂（例如叠氮化钠）存在的条件下溶解性低；而在低浓度下，过氧化酶的活性低。HRP偶联物是广泛用作ELISA（酶联免疫吸附实验）、免疫组化技术、Northern、 Southern和Western blot分析的第二个检测试剂。Amplite比色法过氧化酶检测试剂盒 *蓝色* 提供了一种快速(10分钟)HRP一步法均质的、无需洗脱的分析方案。本试剂盒使用Amplite Blue，我们的超灵敏HRP显色底物，即Amplite Blue作为过氧化酶的显色底物，它比双氧水和过氧化酶及其它的过氧化酶的显色底物（例如TMB, ABTS, OPD 和K-Blue）具有更高的灵敏度。Amplite Blue产生高吸收物质，在664nm处有最大吸收峰。这种近红外吸收使自动化检测生物样品时本底吸收很小。本试剂盒可以用于ELISA，酶促反应动力学分析，氧化酶抑制剂高通量筛选等。试剂盒经过最优化处理，并且可用于高通量液体处理设备。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供最优质的Amplite 比色法过氧化酶检测试剂盒。 

产品说明书

样品实验方案

简要概述

1.准备HRP工作溶液（50μL）
2.添加HRP标准品和/或测试样品（50μL）
3.在室温下孵育10-30分钟
4.监测664±5 nm的吸光度

溶液制备 

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
1.1 Amplite 蓝色过氧化物酶底物储备液（100X）：
将250μLDMSO（组分E）加入到Amplite 蓝色底物（组分A）的小瓶中以制备100X Amplite 蓝色过氧化物酶底物储备溶液。

1.2 HRP标准溶液（20 U / mL）：
将1mL测定缓冲液（组分C）加入到HRP小瓶（组分D）中以制备20U / mL HRP储备溶液。

1.3 H₂O₂溶液（20 mM）：
将22.7μL的3％H₂O₂（0.88M，组分B）加入977μL的测定缓冲液（组分C）中以制备20mM H₂O₂溶液。 注意：稀释的H₂O₂溶液不稳定。 应丢弃未使用的部分。

2.标准溶液

HRP标准
将15μL的20U / mL HRP溶液加入985μL的测定缓冲液（组分C）中，得到300mU / mL的HRP标准溶液（SD7）。 取300 mU / mL HRP标准溶液（SD7），进行1：3连续稀释，得到连续稀释的HRP标准品（SD6 – SD1）和分析缓冲液（组分C）。

3.工作溶液

将50μL的Amplite Blue Peroxidase Substrate储备液（100X）和50μL的H₂O₂储备溶液（20 mM）加入到4.9 mL的分析缓冲液（组分C）中，使总体积为5 mL的HRP工作溶液，避光。

样品分析

表1.白壁/透明底96孔微孔板中HRP标准品和测试样品的布局。 SD = HRP标准品（SD1-SD7,0.3至300 mU / mL）; BL =空白对照; TS =测试样品。

表2.每个孔的试剂组成

1.根据表1和2中提供的布局制备HRP标准品（SD），空白对照品（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用25μL试剂代替50μL。

2.向HRP标准品，空白对照和测试样品的每个孔中加入50μLHRP工作溶液，使总HRP测定体积为100μL/孔。 对于384孔板，在每个孔中加入25μLHRP工作溶液，总体积为50μL/孔。

3.在室温下孵育反应30至60分钟，避光。

4.用吸光度读板仪在664±5nm下监测吸光度。

参考文献

Enzymatic oxidation of dipyridamole in homogeneous and micellar solutions in the horseradish peroxidase-hydrogen peroxide system
Authors: Almeida LE, Imasato H, Tabak M.
Journal: Biochim Biophys Acta (2006): 216

Horseradish peroxidase-driven fluorescent labeling of nanotubes with quantum dots
Authors: Didenko VV, Baskin DS.
Journal: Biotechniques (2006): 295

Recent advances in catalytic peroxidase histochemistry
Authors: Krieg R, Halbhuber KJ.
Journal: Cell Mol Biol (Noisy-le-grand) (2003): 547

Vesicular transport route of horseradish C1a peroxidase is regulated by N- and C-terminal propeptides in tobacco cells
Authors: Matsui T, Nakayama H, Yoshida K, Shinmyo A.
Journal: Appl Microbiol Biotechnol (2003): 517

Development of a novel enzyme/prodrug combination for gene therapy of cancer: horseradish peroxidase/indole-3-acetic acid
Authors: Greco O, Folkes LK, Wardman P, Tozer GM, Dachs GU.
Journal: Cancer Gene Ther (2000): 1414

Preparation, morphological characterization, and activity of thin films of horseradish peroxidase
Authors: Vianello F, Zennaro L, Di Paolo ML, Rigo A, Malacarne C, Scarpa M.
Journal: Biotechnol Bioeng (2000): 488

Synthesis and purification of horseradish peroxidase-labeled oligonucleotides for tyramide-based fluorescence in situ hybridization
Authors: van Gijlswijk RP, van de Corput MP, Bezrookove V, Wiegant J, Tanke HJ, Raap AK.
Journal: Histochem Cell Biol (2000): 175

Evidence for free radical formation during the oxidation of 2′-7′-dichlorofluorescin to the fluorescent dye 2′-7′-dichlorofluorescein by horseradish peroxidase: possible implications for oxidative stress measurements
Authors: Rota C, Chignell CF, Mason RP.
Journal: Free Radic Biol Med (1999): 873

In situ identification of cyanobacteria with horseradish peroxidase-labeled, rRNA-targeted oligonucleotide probes
Authors: Schonhuber W, Zarda B, Eix S, Rippka R, Herdman M, Ludwig W, Amann R.
Journal: Appl Environ Microbiol (1999): 1259

Relative number of cells projecting from contralateral and ipsilateral nucleus isthmi to loci in the optic tectum is dependent on visuotopic location: horseradish peroxidase study in the leopard frog
Authors: Dudkin EA, Gruberg ER.
Journal: J Comp Neurol (1999): 212

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样品实验方案

简要概述

1.准备HRP工作溶液（50μL）
2.添加HRP标准品和/或测试样品（50μL）
3.在室温下孵育10-30分钟
4.监测664±5 nm的吸光度

溶液制备 

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
1. Amplite 红色过氧化物酶底物储备液（100X）：
将250μLDMSO（组分E）加入到Amplite 红色过氧化物酶底物（组分A）的小瓶中以制备100X Amplite 红色过氧化物酶底物储备溶液。 应立即使用原液，避光。

2. HRP标准溶液（20 U / mL）：
将1mL测定缓冲液（组分C）加入到辣根过氧化物酶（组分D）的小瓶中以制备20U / mL的HRP标准溶液。

3. H₂O₂储备溶液（20 mM）：
将22.7μL的3％H₂O₂（0.88M，组分B）加入977μL的测定缓冲液（组分C）中以制备20mM H₂O₂储备溶液。 注意：稀释的H₂O₂溶液不稳定。 应丢弃未使用的部分。

2.标准溶液

HRP标准
在1999μL分析缓冲液（组分C）中加入1μL的20U / mL HRP标准溶液，得到10mU / mL HRP标准溶液（SD7）。 取10 mU / mL HRP标准溶液（SD7）并进行1：3连续稀释，得到连续稀释的HRP标准品（SD6-SD1）和分析缓冲液（组分C）。

3.工作溶液

将50μL的100X Amplite 红色过氧化物酶底物储备溶液和50μL的20mM H₂O₂储备溶液加入到4.9mL的测定缓冲液（组分C）中以制备HRP工作溶液，避光。

样品分析

表1.实心黑色96孔微孔板中HRP标准品和测试样品的布局。 SD = HRP标准品（SD1-SD7,0.01至10 mU / mL）; BL =空白对照; TS =测试样品。

表2.每个孔的试剂组成

1.根据表1和2中提供的布局制备HRP标准品（SD），空白对照品（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用25μL试剂代替50μL。注意：高水平的HRP（例如，> 100mU / mL终浓度）可能由于Amplite TM Red（至非荧光）的过度氧化而导致荧光信号降低。

2.向HRP标准品，空白对照和测试样品的每个孔中加入50μLHRP工作溶液，使总HRP测定体积为100μL/孔。对于384孔板，在每个孔中加入25μLHRP工作溶液，总体积为50μL/孔。

3.在室温下孵育反应10至30分钟，避光。

4.用荧光板读数器在激发= 540±10nm，发射= 590±10nm（最佳Ex / Em = 540 / 590nm，截止= 575nm）监测荧光增加。注意：也可以将板的内容物转移到白色透明底板上，并用吸光度酶标仪在576±5nm的波长下读数。与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。

参考文献

Identification of acetylcholinesterase inhibitors using homogenous cell-based assays in quantitative high-throughput screening platforms
Authors: Shuaizhang Li, Ruili Huang, Samuel Solomon, Yitong Liu, Bin Zhao, Michael F Santillo, Menghang Xia
Journal: Biotechnology journal (2017): 1600715

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样品实验方案

简要概述

1.准备HRP工作溶液（50μL）
2.添加HRP标准品和/或测试样品（50μL）
3.在室温下孵育30分钟至2小时
4.监测发光强度

溶液制备 

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
1.1 HRP原液（20 U / mL）：
将1mL含有0.1％BSA的PBS加入到辣根过氧化物酶（组分C）的小瓶中。

2.标准溶液

HRP标准
在1999μL含0.1％BSA的PBS中加入1μL20U / mL HRP储备液，得到10 mU / mL HRP标准溶液（PS7）。 然后使用10 mU / mL标准溶液并进行1：2连续稀释以获得剩余的连续稀释的标准品（PS6-PS1）。

3.工作溶液

将30μL3％稳定的H₂O₂溶液（组分B）加入5mL分析缓冲液（组分A）中以制备HRP工作溶液并避光。 注意：HRP工作溶液在室温下稳定至少8小时，如果避光，不会造成活性损失。

样品分析

表1.实心黑色96孔微孔板中HRP标准品和测试样品的布局。 PS =过氧化物酶标准品（PS1-PS7,0.156至10mU / mL），BL =空白对照，TS =测试样品。

表2.每个孔的试剂组成

1.根据表1和2中提供的布局制备HRP标准品（PS），空白对照品（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用25μL试剂代替50μL。

2.向HRP标准品，空白对照和测试样品的每个孔中加入50μLHRP工作溶液，使总HRP测定体积为100μL/孔。 对于384孔板，在每个孔中加入25μLHRP工作溶液，总体积为50μL/孔。

3.在室温下孵育反应30分钟至2小时，避光。

4.使用标准光度计监测发光强度。

Amplite 荧光法谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒 红色荧光

简要概述

Amplite 荧光法谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒 红色荧光 是美国AAT Bioquest生产的检测谷胱甘肽过氧化物酶的试剂盒，谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）是具有过氧化物酶活性的酶家族，以保护生物体免受氧化损伤。GPx在将有机氢过氧化物（例如脂质氢过氧化物）还原成其相应的醇或将游离过氧化氢还原成水。因此，它可以防止细胞膜和细胞中其他氧化剂敏感位点的氧化损伤。现在科研已经注意到，改变GPx水平与由许多评论和复杂疾病引起的损伤相关。在生物样品中测量GPx水平，作为潜在治疗癌症，糖尿病，神经退行性疾病和心血管疾病的潜在指标。AAT Bioquest的荧光谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒提供灵敏的荧光测定法，用于测量生物样品中的GPx水平。该测定基于GPx催化的谷胱甘肽（GSH）氧化成氧化型谷胱甘肽（GSSG）。生成的GSSG通过谷胱甘肽还原酶（GR）和NADPH再循环至还原态GSH：

R-O-O-H + 2GSH     ^GPx             R-O-H + GSSG + H₂O

GSSG + NADPH + H^{+        GR}           2GSH + NADP⁺

产品NADP +可以使用我们新开发的专有NADP传感器Quest Fluor™NADP Probe进行专门监控。 NADP传感器仅与NADP反应产生荧光产物。 荧光信号可以用荧光酶标仪在Ex / Em = 420 / 480nm处测量，其与GPx活性成正比。与测量NADPH在340 nm处吸光度降低的其他商业试剂盒相比，我们的Quest Fluor™NADP探针可用于直接量化NADP水平。通过这种荧光测定GPx测定，我们能够在155μL反应体积中检测低至1.2 mU / mL的GPx。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供最优质的Amplite 荧光法谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒。 

产品说明书

96孔板的测定方案

概述

准备GPx分析混合物（50μL）

添加GPx标准品或测试样品（50μL）

在室温下孵育30分钟

加入20μLQuestFluor™NADP探针

添加20μLNAP检测溶液

在室温下孵育10-20分钟

添加15μL增强剂

溶液在室温孵育30-60分钟，在Ex / Em = 420 / 480nm处记录荧光

注意1.为了获得最佳效果，强烈建议使用黑色版。

注意2.在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分的一个小瓶。

操作方法

1.制备谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）标准储备液：

将50μLddH2O或1×PBS缓冲液加入到GPx标准品（组分A）的小瓶中，制成10U / mL标准储备溶液。

注意：未使用的GPx标准储备溶液应分为单次使用的等分试样并储存在-20ºC。

2.准备GPx标准的系列稀释液：

2.1将4μLGPx标准储备溶液（10U / mL，来自步骤1）加入996L 1×PBS缓冲液中，以产生浓度为40mU / mL的标准溶液。

注意：稀释的GPx标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

2.2取200μL40mU / mL GPx标准溶液进行1：2连续稀释，得到大约20,10,5,2.5,1.25,0.625和0 mU / mL的GPx标准品系列稀释液。

2.3如表1和2中所述，将GPx标准品和含有GPx的测试样品的系列稀释液加入到固体黑色96孔微量培养板中。

表1实心黑色96孔微孔板中GPx标准品和测试样品的布局

注意：GP = GPx标准，BL =空白对照，TS =测试样品。

表2每个孔的试剂组成

*注意：将连续稀释的GPx标准品从大约0.6 mU / mL加到40 mU / mL，一式两份加入GP1到GP7的孔中。

3.准备GSH原液（100X）：

将100μlddH2 O加入到GSH小瓶（组分D）中以制备100X GSH储备溶液。

4.准备GPx底物储备液（100X）：

将100μlddH2O加入到基质小瓶（组分E）中以制备100X底物储备溶液。

5.准备GPx分析混合物：

5.1将5 mL测定缓冲液（组分B）加入一瓶酶混合物（组分C）中。

5.2将50μLGSH储备溶液（来自步骤3的组分D），50μL底物储备溶液（组分E，来自步骤4）加入到组分B + C的瓶子中（来自步骤5.1），并充分混合以进行GPx测定 混合物（组分B + C + D + E）。

注1：该GPx测定混合物足以用于一个96孔板。 它不稳定，请及时使用。

注2：不建议储存未使用的GPx分析混合物。 可以将未使用的组分B + C混合物（来自步骤5.1）分成单次使用的等分试样并储存在-20ºC，尽管灵敏度可能会降低。

注3; 将未使用的100X GSH储备溶液（来自步骤3）和100X GPx底物储备溶液（来自步骤4）分成单次使用的等分试样并储存在-20ºC。

6.运行GPx分析：

6.1将50μLGPx测定混合物（来自步骤5.2）加入到GPx标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤2.3），使总体积为100μL/孔。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLGPx测定混合物。

6.2在室温下孵育反应30分钟，避光。

7.运行NADP测定：

7.1将20μLQuestFluor™NADP探针（组分F）加入到GPx标准品，空白对照品和测试样品的每个孔中，充分混合。

7.2在每个孔中加入20μLNAP检测溶液（组分G），充分混匀。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和10μLQuestFluor™NADP探针（组分F）和10μLNAP检测溶液（组分G）。

7.3在室温下孵育反应10-20分钟，避光。

7.4向每个孔中加入15μL增强剂（组分H），使总测定体积为155μL/孔，并在室温下孵育30-60分钟，避光。

注意：对于384孔板，添加7.5μL增强剂。

7.5使用荧光读板仪在Ex / Em = 420/480 nm处监测荧光增加。

参考文献

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A supramolecular microgel glutathione peroxidase mimic with temperature responsive activity
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Can recombinant human glutathione peroxidase 1 with high activity be efficiently produced in Escherichia coli
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