钙离子荧光探针Fura Red,钾盐

	货号	21045	存储条件	在零下15度以下保存, 避免光照
	规格	1 mg	价格	4488
	Ex (nm)	435	Em (nm)	639
	分子量	808.98	溶剂	Water
	产品详细介绍

简要概述

Fura Red是可见光可激发的fura-2类似物，当与单一激发的绿色荧光钙指示剂一起使用时，通过显微光度法，成像或流式细胞术，可用于比率测量单细胞中的钙离子，提供了独特的可能性。Fura Red AM是用于非侵入性细胞内装载的Fura Red的细胞渗透性版本。Fura Red AM可以使用Fluo-3 AM，Fluo-8 AM或Cal-520 AM同时加载到单元中。结合两种钙染料的优点是可以使用具有更长激发波长的染料。与使用比例或紫外线或近紫外线（例如Fura-2）激发的比例染料相比，这通常对细胞造成的伤害较小，因为可见波长的光的光毒性较小。

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钙离子篇：时间轴式讲解应用于钙离子检测的探针

产品说明书

使用Cal-520 AM，Cal-570 AM或Cal-630 AM酯类

1.使用Cal-520 ，Cal-590 或Cal-630 AM酯：

        AM酯是非极性酯，其易于穿过活细胞膜，并且通过活细胞内的细胞酯酶快速水解。AM酯广泛用于非侵入性地将各种极性荧光探针装载到活细胞中。但是，使用AM酯时必须小心，因为它们易于水解，特别是在溶液中。它们应在使用前重新配制成高质量的无水二甲基亚砜（DMSO）。DMSO储备溶液可以在-20℃下干燥储存并避光。在这些条件下，AM酯应稳定数月。以下是我们推荐的将Cal-520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM酯加入活细胞的方案。该方案仅提供指南，实际应根据您的具体需求进行修改。

a）在高质量无水DMSO中制备2至5 mM Cal-520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM酯的储备溶液。

b）在实验当天，将Cal-520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM溶解在DMSO中或将等份的指示剂储备溶液解冻至室温。在Hanks和Hepes缓冲液（HHBS）或您选择的缓冲液（0.04％Pluronic®F-127）中制备10至20μM的染料工作溶液。细胞加载所需指示剂的确切浓度必须凭经验确定。

注意：非离子型洗涤剂Pluronic®F-127有时用于增加Cal-520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM酯的水溶性。

c）如果您的细胞（如CHO细胞）含有有机阴离子转运蛋白，可将丙磺舒（1-2 mM）加入染料工作溶液中（最终浓度为0.5-1 mM）以减少渗漏去酯化指标。

d）将等体积的染料工作溶液（来自步骤b或c）加入细胞板中。

e）将染料加载板在细胞培养箱中孵育60至90分钟，然后在室温下将板孵育另外30分钟。

注意：孵育染料超过2小时可以为某些细胞系提供更好的信号强度。

f）用HHBS或您选择的缓冲液（含有阴离子转运蛋白抑制剂，如1mM丙磺舒，如果适用）替换染料工作溶液，以去除多余的探针。

g）在Ex / Em = 490 / 525nm（对于Cal-520 AM），540 / 5000nm（对于Cal-590 AM）或600 / 640nm（对于Cal-630 AM）进行实验。

2.测量细胞内钙响应：

为了确定溶液的游离钙浓度或单波长钙指示剂的Kd，使用以下等式：

[Ca]free = Kd[F ─ Fmin]/Fmax ─ F]

其中F是实验钙水平下指示剂的荧光，Fmin是不存在钙时的荧光，Fmax是钙饱和探针的荧光。

        解离常数（Kd）是探针对钙的亲和力的量度。 与校准溶液相比，荧光指示剂的Ca结合和光谱性质在细胞环境中变化非常显着。 细胞内指标的原位反应校准通常产生显着高于体外测定的Kd值。 通过在离子载体如A-23187,4-溴A-23187和离子霉素存在下将加载的细胞暴露于受控的Ca²⁺缓冲液来进行原位校准。 或者，细胞透化剂如洋地黄皂苷或X-100可用于将指示剂暴露于细胞外培养基的受控Ca²⁺水平。

参考文献

Ratiometric analysis of fura red by flow cytometry: a technique for monitoring intracellular calcium flux in primary cell subsets
Authors: Wendt ER, Ferry H, Greaves DR, Keshav S.
Journal: PLoS One (2015): e0119532

A flow cytometric comparison of Indo-1 to fluo-3 and Fura Red excited with low power lasers for detecting Ca(2+) flux
Authors: Bailey S, Macardle PJ.
Journal: J Immunol Methods (2006): 220

Use of co-loaded Fluo-3 and Fura Red fluorescent indicators for studying the cytosolic Ca(2+)concentrations distribution in living plant tissue
Authors: Walczysko P, Wagner E, Albrechtova JT.
Journal: Cell Calcium (2000): 23

[Monitoring calcium in outer hair cells with confocal microscopy and fluorescence ratios of fluo-3 and fura-red]
Authors: Su ZL, Li N, Sun YR, Yang J, Wang IM, Jiang SC.
Journal: Shi Yan Sheng Wu Xue Bao (1998): 323

Calcium transient alternans in blood-perfused ischemic hearts: observations with fluorescent indicator fura red
Authors: Wu Y, Clusin WT.
Journal: Am J Physiol (1997): H2161

Problems associated with using Fura-2 to measure free intracellular calcium concentrations in human red blood cells
Authors: Blackwood AM, Sagnella GA, Markandu ND, MacGregor GA.
Journal: J Hum Hypertens (1997): 601

IgG-induced Ca2+ oscillations in differentiated U937 cells; a study using laser scanning confocal microscopy and co-loaded fluo-3 and fura-red fluorescent probes
Authors: Floto RA, Mahaut-Smith MP, Somasundaram B, Allen JM.
Journal: Cell Calcium (1995): 377

Improved sensitivity in flow cytometric intracellular ionized calcium measurement using fluo-3/Fura Red fluorescence ratios
Authors: Novak EJ, Rabinovitch PS.
Journal: Cytometry (1994): 135

Localization of calcium entry through calcium channels in olfactory receptor neurones using a laser scanning microscope and the calcium indicator dyes Fluo-3 and Fura-Red
Authors: Schild D, Jung A, Schultens HA.
Journal: Cell Calcium (1994): 341

The distribution of intracellular calcium chelator (fura-2) in a population of intact human red cells
Authors: Lew VL, Etzion Z, Bookchin RM, daCosta R, Vaananen H, Sassaroli M, Eisinger J.
Journal: Biochim Biophys Acta (1993): 152

钙离子荧光探针Fura Red, 钾盐

	货号	21047	存储条件	在零下15度以下保存, 避免光照
	规格	10×50 ug	价格	3192
	Ex (nm)	435	Em (nm)	639
	分子量	808.98	溶剂	Water
	产品详细介绍

简要概述

Fura Red是可见光可激发的fura-2类似物，当与单一激发的绿色荧光钙指示剂一起使用时，通过显微光度法，成像或流式细胞术，可用于比率测量单细胞中的钙离子，提供了独特的可能性。Fura Red AM是用于非侵入性细胞内装载的Fura Red的细胞渗透性版本。Fura Red AM可以使用Fluo-3 AM，Fluo-8 AM或Cal-520 AM同时加载到单元中。结合两种钙染料的优点是可以使用具有更长激发波长的染料。与使用比例或紫外线或近紫外线（例如Fura-2）激发的比例染料相比，这通常对细胞造成的伤害较小，因为可见波长的光的光毒性较小。

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钙离子篇：时间轴式讲解应用于钙离子检测的探针

产品说明书

使用Cal-520 AM，Cal-570 AM或Cal-630 AM酯类

1.使用Cal-520 ，Cal-590 或Cal-630 AM酯：

        AM酯是非极性酯，其易于穿过活细胞膜，并且通过活细胞内的细胞酯酶快速水解。AM酯广泛用于非侵入性地将各种极性荧光探针装载到活细胞中。但是，使用AM酯时必须小心，因为它们易于水解，特别是在溶液中。它们应在使用前重新配制成高质量的无水二甲基亚砜（DMSO）。DMSO储备溶液可以在-20℃下干燥储存并避光。在这些条件下，AM酯应稳定数月。以下是我们推荐的将Cal-520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM酯加入活细胞的方案。该方案仅提供指南，实际应根据您的具体需求进行修改。

a）在高质量无水DMSO中制备2至5 mM Cal-520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM酯的储备溶液。

b）在实验当天，将Cal-520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM溶解在DMSO中或将等份的指示剂储备溶液解冻至室温。在Hanks和Hepes缓冲液（HHBS）或您选择的缓冲液（0.04％Pluronic®F-127）中制备10至20μM的染料工作溶液。细胞加载所需指示剂的确切浓度必须凭经验确定。

注意：非离子型洗涤剂Pluronic®F-127有时用于增加Cal-520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM酯的水溶性。

c）如果您的细胞（如CHO细胞）含有有机阴离子转运蛋白，可将丙磺舒（1-2 mM）加入染料工作溶液中（最终浓度为0.5-1 mM）以减少渗漏去酯化指标。

d）将等体积的染料工作溶液（来自步骤b或c）加入细胞板中。

e）将染料加载板在细胞培养箱中孵育60至90分钟，然后在室温下将板孵育另外30分钟。

注意：孵育染料超过2小时可以为某些细胞系提供更好的信号强度。

f）用HHBS或您选择的缓冲液（含有阴离子转运蛋白抑制剂，如1mM丙磺舒，如果适用）替换染料工作溶液，以去除多余的探针。

g）在Ex / Em = 490 / 525nm（对于Cal-520 AM），540 / 5000nm（对于Cal-590 AM）或600 / 640nm（对于Cal-630 AM）进行实验。

2.测量细胞内钙响应：

为了确定溶液的游离钙浓度或单波长钙指示剂的Kd，使用以下等式：

[Ca]free = Kd[F ─ Fmin]/Fmax ─ F]

其中F是实验钙水平下指示剂的荧光，Fmin是不存在钙时的荧光，Fmax是钙饱和探针的荧光。

        解离常数（Kd）是探针对钙的亲和力的量度。 与校准溶液相比，荧光指示剂的Ca结合和光谱性质在细胞环境中变化非常显着。 细胞内指标的原位反应校准通常产生显着高于体外测定的Kd值。 通过在离子载体如A-23187,4-溴A-23187和离子霉素存在下将加载的细胞暴露于受控的Ca²⁺缓冲液来进行原位校准。 或者，细胞透化剂如洋地黄皂苷或X-100可用于将指示剂暴露于细胞外培养基的受控Ca²⁺水平。

参考文献

Ratiometric analysis of fura red by flow cytometry: a technique for monitoring intracellular calcium flux in primary cell subsets
Authors: Wendt ER, Ferry H, Greaves DR, Keshav S.
Journal: PLoS One (2015): e0119532

A flow cytometric comparison of Indo-1 to fluo-3 and Fura Red excited with low power lasers for detecting Ca(2+) flux
Authors: Bailey S, Macardle PJ.
Journal: J Immunol Methods (2006): 220

Use of co-loaded Fluo-3 and Fura Red fluorescent indicators for studying the cytosolic Ca(2+)concentrations distribution in living plant tissue
Authors: Walczysko P, Wagner E, Albrechtova JT.
Journal: Cell Calcium (2000): 23

[Monitoring calcium in outer hair cells with confocal microscopy and fluorescence ratios of fluo-3 and fura-red]
Authors: Su ZL, Li N, Sun YR, Yang J, Wang IM, Jiang SC.
Journal: Shi Yan Sheng Wu Xue Bao (1998): 323

Calcium transient alternans in blood-perfused ischemic hearts: observations with fluorescent indicator fura red
Authors: Wu Y, Clusin WT.
Journal: Am J Physiol (1997): H2161

Problems associated with using Fura-2 to measure free intracellular calcium concentrations in human red blood cells
Authors: Blackwood AM, Sagnella GA, Markandu ND, MacGregor GA.
Journal: J Hum Hypertens (1997): 601

IgG-induced Ca2+ oscillations in differentiated U937 cells; a study using laser scanning confocal microscopy and co-loaded fluo-3 and fura-red fluorescent probes
Authors: Floto RA, Mahaut-Smith MP, Somasundaram B, Allen JM.
Journal: Cell Calcium (1995): 377

Improved sensitivity in flow cytometric intracellular ionized calcium measurement using fluo-3/Fura Red fluorescence ratios
Authors: Novak EJ, Rabinovitch PS.
Journal: Cytometry (1994): 135

Localization of calcium entry through calcium channels in olfactory receptor neurones using a laser scanning microscope and the calcium indicator dyes Fluo-3 and Fura-Red
Authors: Schild D, Jung A, Schultens HA.
Journal: Cell Calcium (1994): 341

The distribution of intracellular calcium chelator (fura-2) in a population of intact human red cells
Authors: Lew VL, Etzion Z, Bookchin RM, daCosta R, Vaananen H, Sassaroli M, Eisinger J.
Journal: Biochim Biophys Acta (1993): 152

钙离子荧光探针Quin-2, 四钾盐 CAS 149022-19-5

	货号	21052	存储条件	在零下15度以下保存, 避免光照
	规格	5 mg	价格	1896
	Ex (nm)	353	Em (nm)	495
	分子量	693.87	溶剂	Water
	产品详细介绍

简要概述

钙离子荧光探针Quin-2, 四钾盐是美国AAT Bioquest生产的钙离子荧光探针，Quin-2能够紧密结合钙离子，它类似于EGTA，与钙的结合比镁更加紧密。它与钙结合会引起紫外吸收和荧光的巨大改变。与钙结合时，荧光波长比没有与钙结合时更长；当受两种不同波长的光激发时，两种不同波长荧光强度的比率告诉大家所结合游离钙离子的浓度比率关系。游离的Quin-2的浓度可以被精确地测定，所以游离钙离子的浓度也可以准确的计算出来。Quin-2可以被注入细胞，用来检测细胞内钙离子浓度时时刻刻的变化。Quin-2 AM具有细胞渗透性，可以用来研究活细胞。金畔生物是AAT Bioquest 的中国代理商，为您提供最优质的钙离子荧光探针。

钙离子篇：时间轴式讲解应用于钙离子检测的探针

产品说明书

使用钙指示剂AM酯类

1.使用钙指示剂AM Esters加载细胞：

        AM酯是非极性酯，其易于穿过活细胞膜，并且通过活细胞内的细胞酯酶快速水解。AM酯广泛用于非侵入性地将各种极性荧光探针装载到活细胞中。但是，使用AM酯时必须小心，因为它们易于水解，特别是在溶液中。它们应该用高质量的无水二甲基亚砜（DMSO）重新配制。DMSO储备溶液应在-20°C下干燥储存并避光。在这些条件下，AM酯应稳定数月。

以下是我们推荐的将AM酯加载到活细胞中的方案。该方案仅提供指南，实际应根据您的具体需求进行修改。

a）在高质量无水DMSO中制备2至5 mM AM酯原液。

b）在实验当天，将钙指示剂溶解在DMSO中或将等份的指示剂储备溶液解冻至室温。使用0.04％Pluronic®F-127在您选择的缓冲液（如Hanks和Hepes缓冲液）中制备2至20μM的工作溶液。对于大多数细胞系，我们建议钙指示剂的最终浓度为4-5 uM。细胞加载所需指标的确切浓度必须根据经验确定。为避免因过载和潜在染料毒性引起的任何伪影，建议使用可产生足够信号强度的最小探针浓度。

注意：非离子洗涤剂Pluronic®F-127有时用于增加钙指示剂AM 酯的水溶性。 

c）如果您的细胞（如CHO细胞）含有有机阴离子转运蛋白，可以将丙磺舒（2-5 mM）或磺吡酮（0.2-0.5 mM）添加到染料工作溶液中（最终浓度为1）对于丙磺舒而言为-2.5mM，对于磺胺吡喃酮为0.1-0.25mM，以减少脱酯化指示剂的泄漏。

d）将等体积的染料工作溶液（来自步骤b或c）加入细胞板中。

e）将染料加载板室在温度或37℃下孵育20分钟（特别是Fluo-8AM）至2小时，然后将板在室温下再孵育30分钟。

注1：降低加载温度可能会减少指示符的划分。

注2：孵育Cal-520 AM超过2小时可以为某些细胞系提供更好的信号强度。

f）用HHBS或您选择的缓冲液（含有阴离子转运蛋白抑制剂，如1mM丙磺舒，如果适用）替换染料工作溶液，以去除多余的探针。

g）在所需的Ex / Em波长下进行实验（见表1）。

2.测量细胞内钙响应：

图1. 没有丙磺舒的CHO-M1细胞中内源性P2Y受体对ATP的反应。在96孔黑壁/透明底板中，将CHO-M1细胞以每100μL/孔40,000个细胞接种过夜。将100μl的4μMFluo -3AM，Fluo- 4AM 或Cal202®AM在HHBS中加入孔中，并将细胞在37℃下孵育2小时。用100μlHHBS替换染料加载培养基，加入50μl300μMATP，然后使用FITC通道用荧光显微镜（Olympus IX71）成像。

图2. 用Cal-520 或Fluo-4 AM 测量的CHO-K1细胞中ATP刺激的内源性P2Y受体的钙响应。在96孔黑壁/透明底板中，将CHO-K1细胞以每100μL /孔50,000个细胞接种过夜。100μL的5 μ 中号的Fluo-4 AM或校准- 520® AM与（A）或不具有（B）2.5mM丙磺舒加入到细胞中，并将细胞在37下温育^ø下进行2小时。 通过FlexStation（Molecular Devices）添加ATP（50μL/孔）以达到最终指示的浓度。

使用钙指示剂盐

为了确定溶液的游离钙浓度或 单波长钙指示剂的K _d，使用以下等式：

[Ca] _自由 = K _d [F – F _min ] / F _max – F]

其中F是实验钙水平下指示剂的荧光，F _min 是不存在钙时的荧光，F _max是钙饱和探针的荧光。解离常数（K _d）是探针对钙的亲和力的量度。与校准溶液相比，荧光指示剂的Ca ²⁺结合和光谱性质在细胞环境中变化非常显着。 细胞内指标的原位校准通常产生显着高于体外测定的K _d值。 通过将加载的细胞暴露于受控的Ca来进行原位校准 在离子载体存在下的²⁺缓冲液，例如A-23187,4-溴A-23187和离子霉素。或者，细胞透化剂如洋地黄皂苷或X-100可用于将指示剂暴露 于细胞外培养基的受控Ca ²⁺水平。表1列出了一些钙试剂的K _d值供您参考。

使用钙指示剂结合物

        与游离离子指示剂相比，这些相同指示剂的葡聚糖缀合物表现出减少的区室化和低得多的染料渗漏率。由于葡聚糖的分子量，净电荷，标记程度和染料的性质可能影响实验，因此建议研究人员查阅主要文献以获得更多实验信息。

参考文献

W-5 and quin 2-AM reverse the inhibitory effect of insulin on lipolysis due to dibutyryl cAMP
Authors: Goko H, Matsuoka A.
Journal: Diabetes Res Clin Pract (1999): 101

Calcium chelator Quin-2 prevents crocidolite-induced DNA strand breakage in human white blood cells
Authors: Faux SP, Michelangeli F, Levy LS.
Journal: Mutat Res (1994): 209

Fluorescence lifetime imaging of intracellular calcium in COS cells using Quin-2
Authors: Lakowicz JR, Szmacinski H, Nowaczyk K, Lederer WJ, Kirby MS, Johnson ML.
Journal: Cell Calcium (1994): 7

Possible mechanisms of epinephrine actions in quin-2-loaded platelets refractory to arachidonic acid
Authors: Rao GH, Gerrard JM, Murthy M, White JG.
Journal: Biochem Med Metab Biol (1993): 322

Fluorescence lifetime imaging of calcium using Quin-2
Authors: Lakowicz JR, Szmacinski H, Nowaczyk K, Johnson ML.
Journal: Cell Calcium (1992): 131

Involvement of calcium and iron in Quin 2 toxicity to isolated hepatocytes
Authors: Carpenter-Deyo L, Reed DJ.
Journal: J Pharmacol Exp Ther (1991): 747

Toxicity to isolated hepatocytes caused by the intracellular calcium indicator, Quin 2
Authors: Carpenter-Deyo L, Duimstra JR, Hedstrom O, Reed DJ.
Journal: J Pharmacol Exp Ther (1991): 739

Aspirin, prostaglandin E1 and Quin-2 AM-induced platelet dysfunction: restoration of function by noradrenalin
Authors: Rao GH, White JG.
Journal: Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids (1990): 141

Characterization of indo-1 and quin-2 as spectroscopic probes for Zn2(+)-protein interactions
Authors: Jefferson JR, Hunt JB, Ginsburg A.
Journal: Anal Biochem (1990): 328

Effect of Quin-2 on Ca2+ uptake mediated by Na+i/Ca2+o exchange and 45Ca2+ efflux in rat brain synaptosomes: a requirement for [Ca2+]i
Authors: Blanco P, Martinez-Serrano A, Bogonez E, Satrustegui J.
Journal: Cell Calcium (1990): 25

钙离子荧光探针BTC, AM CAS 176767-94-5

	货号	21054	存储条件	在零下15度以下保存, 避免光照
	规格	1 mg	价格	3192
	Ex (nm)	401	Em (nm)	529
	分子量	979.92	溶剂	DMSO
	产品详细介绍

简要概述

产品基本信息

货号：21054

产品名称：钙离子荧光探针BTC, AM

CAS：176767-94-5

规格：1mg

储存条件：-15℃避光防潮

保质期：24个月

产品物理化学光谱特性

分子量：979.92

溶剂：DMSO

激发波长(nm)：401

发射波长(nm)：529

产品介绍

钙离子荧光探针BTC, AM是美国AAT Bioquest生产的钙离子荧光探针，这种细胞渗透性香豆素Ca2 +指示剂BTC AM在结合Ca2 +时显示出最大激发光从约480 nm到400 nm的偏移，从而可以进行比例钙测量。由于其对Ca2 +的高选择性和低亲和力（Kd〜7 uM），BTC通常用于高细胞内Ca2 +水平的定量。另外，由于th离子增强了BTC的荧光，BTC，AM也已用于监测钾离子通道。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供最优质的钙离子荧光探针BTC, AM。 

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钙离子篇：时间轴式讲解应用于钙离子检测的探针

参考文献

钙离子荧光探针Fluo-8FF, AM

	货号	21104	存储条件	在零下15度以下保存, 避免光照
	规格	10×50 ug	价格	2544
	Ex (nm)	495	Em (nm)	516
	分子量	1082.91	溶剂	DMSO
	产品详细介绍

简要概述

产品基本信息

货号：21104

产品名称：钙离子荧光探针Fluo-8FF, AM

规格：10×50 ug

储存条件：-15℃避光防潮

保质期：24个月

产品物理化学光谱特性

分子量：1082.91

溶剂：DMSO

激发波长(nm)：494

发射波长(nm)：517

产品介绍

钙离子荧光探针Fluo-8FF, AM 是美国AAT Bioquest生产的钙离子荧光探针，钙测量对于许多生物学研究至关重要。在结合Ca2+后显示光谱响应的荧光探针使研究人员能够使用荧光显微镜，流式细胞仪，荧光光谱和荧光酶标仪来研究细胞内游离Ca2+浓度的变化。在可见光激发钙指示剂中，Fluo-3和Fluo-4最常用。但是，Fluo-3 AM和Fluo-4 AM在酯酶水解后在活细胞中仅适度发荧光，并且需要苛刻的细胞加载条件才能最大化其细胞钙反应。开发Fluo-8®染料可改善细胞负载和钙响应，同时保持便捷的Fluo-3和Fluo-4光谱波长（在〜490 nm处具有最大激发和在〜520 nm处具有最大发射）。Fluo-8®AM仅需要室温，而Fluo-3 AM和Fluo-4 AM需要37℃的细胞负载。此外，Fluo-8®的亮度是Fluo-4 AM的2倍，是Fluo-3 AM的4倍。AAT Bioquest提供了一套出色的Fluo-8®试剂，具有不同的钙结合亲和力（Fluo-8®：Kd = 389 nM； Fluo-8H：Kd = 232 nM； Fluo-8L：Kd = 1.86 µM； Fluo-8FF ：Kd = 10 µM）。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供最优质的钙离子荧光探针Fluo-8FF, AM 。 

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钙离子篇：时间轴式讲解应用于钙离子检测的探针

试剂应用文献

AMPA receptors in the synapse turnover by monomer diffusion
Authors: Morise, Jyoji and Suzuki, Kenichi GN and Kitagawa, Ayaka and Wakazono, Yoshihiko and Takamiya, Kogo and Tsunoyama, Taka A and Nemoto, Yuri L and Takematsu, Hiromu and Kusumi, Akihiro and Oka, Shogo
Journal: Nature communications (2019): 1–18

Cryo-EM Studies of TMEM16F Calcium-Activated Ion Channel Suggest Features Important for Lipid Scrambling
Authors: Feng, Shengjie and Dang, Shangyu and Han, Tina Wei and Ye, Wenlei and Jin, Peng and Cheng, Tong and Li, Junrui and Jan, Yuh Nung and Jan, Lily Yeh and Cheng, Yifan
Journal: Cell Reports (2019): 567–579

Discrimination of Dormant and Active Hematopoietic Stem Cells by G0 Marker Reveals Dormancy Regulation by Cytoplasmic Calcium
Authors: Fukushima, Tsuyoshi and Tanaka, Yosuke and Hamey, Fiona K and Chang, Chih-Hsiang and Oki, Toshihiko and Asada, Shuhei and Hayashi, Yasutaka and Fujino, Takeshi and Yonezawa, Taishi and Takeda, Reina and others
Journal: Cell Reports (2019): 4144–4158

Ketamine Increases Proliferation of Human iPSC-Derived Neuronal Progenitor Cells via Insulin-Like Growth Factor 2 and Independent of the NMDA Receptor
Authors: Grossert, Aless and ra and Mehrjardi, Narges Zare and Bailey, Sarah J and Lindsay, Mark A and Hescheler, Jürgen and Saric, Tomo and Teusch, Nicole
Journal: Cells (2019): 1139

MRGPRX4 is a bile acid receptor for human cholestatic itch
Authors: Yu, Huasheng and Zhao, Tianjun and Liu, Simin and Wu, Qinxue and Johnson, Omar and Wu, Zhaofa and Zhuang, Zihao and Shi, Yaocheng and Peng, Luxin and He, Renxi and others
Journal: eLife (2019): e48431

P2Y6 signaling in alveolar macrophages prevents leukotriene-dependent type 2 allergic lung inflammation
Authors: Nagai, Jun and Balestrieri, Barbara and Fanning, Laura B and Kyin, Timothy and Cirka, Haley and Lin, Junrui and Idzko, Marco and Zech, Andreas and Kim, Edy Y and Brennan, Patrick J and others
Journal: The Journal of clinical investigation (2019)

Hyperglycaemia disrupts conducted vasodilation in the resistance vasculature of db/db mice
Authors: Lemmey, Hamish AL and Ye, Xi and Ding, Hong C and Triggle, Christopher R and Garland, Christopher J and Dora, Kim A
Journal: Vascular pharmacology (2018): 29–35

Methionine and valine activate the mammalian target of rapamycin complex 1 pathway through heterodimeric amino acid taste receptor (TAS1R1/TAS1R3) and intracellular Ca2+ in bovine mammary epithelial cells
Authors: Zhou, Y and Zhou, Z and Peng, J and Loor, Juan J
Journal: Journal of dairy science (2018): 11354–11363

TRPA1-dependent reversible opening of tight junction by natural compounds with an $alpha$, $beta$-unsaturated moiety and capsaicin
Authors: Kanda, Yusuke and Yamasaki, Youhei and Sasaki-Yamaguchi, Yoshie and Ida-Koga, Noriko and Kamisuki, Shinji and Sugawara, Fumio and Nagumo, Yoko and Usui, Takeo
Journal: Scientific reports (2018): 1–13

A new electro-optical approach for conductance measurement: an assay for the study of drugs acting on ligand-gated ion channels
Authors: Menegon, A and Pitassi, S and Mazzocchi, N and Redaelli, L and Rizzetto, R and Roll and JF and Poli, C and Imberti, M and Lanati, A and Grohovaz, F
Journal: Scientific Reports (2017)

Altered spontaneous calcium signaling of in situ chondrocytes in human osteoarthritic cartilage
Authors: Gong, Xiaoyuan and Xie, Wenbin and Wang, Bin and Gu, Lingchuan and Wang, Fuyou and Ren, Xiang and Chen, Cheng and Yang, Liu
Journal: Scientific reports (2017): 17093

Bystander effects elicited by single-cell photo-oxidative blue-light stimulation in retinal pigment epithelium cell networks
Authors: Ishii, Masaaki and Rohrer, Bärbel
Journal: Cell Death Discovery (2017): 16071

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Authors: Ishii, Masaaki and Rohrer, Bärbel
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High-throughput screen detects calcium signaling dysfunction in typical sporadic autism spectrum disorder
Authors: Schmunk, Galina and Nguyen, Rachel L and Ferguson, David L and Kumar, Kenny and Parker, Ian and Gargus, J Jay
Journal: Scientific Reports (2017): 40740

参考文献

钙离子荧光探针Rhod-4, 钠盐

	货号	21118	存储条件	在零下15度以下保存, 避免光照
	规格	1 mg	价格	6432
	Ex (nm)	523	Em (nm)	551
	分子量	815.64	溶剂	Water
	产品详细介绍

简要概述

钙离子荧光探针Rhod-4, 钠盐是美国AAT Bioquest生产的用于钙通量测定的试剂，钙测量对于许多生物学研究至关重要。在结合Ca2+后显示光谱响应的荧光探针使研究人员能够使用荧光显微镜，流式细胞仪，荧光光谱和荧光酶标仪来研究细胞内游离Ca2+浓度的变化。在可见光激发钙指示剂中，Fluo-3和Fluo-4最常用。但是，Fluo-3 AM和Fluo-4 AM在酯酶水解后在活细胞中仅适度发荧光，并且需要苛刻的细胞加载条件才能最大化其细胞钙反应。开发Fluo-8®染料可改善细胞负载和钙响应，同时保持便捷的Fluo-3和Fluo-4光谱波长（在〜490 nm处具有最大激发和在〜520 nm处具有最大发射）。Fluo-8®AM仅需要室温，而Fluo-3 AM和Fluo-4 AM需要37℃的细胞负载。此外，Fluo-8®的亮度是Fluo-4 AM的2倍，是Fluo-3 AM的4倍。AAT Bioquest提供了一套出色的Fluo-8®试剂，具有不同的钙结合亲和力（Fluo-8®：Kd = 389 nM； Fluo-8H：Kd = 232 nM； Fluo-8L：Kd = 1.86 µM； Fluo-8FF ：Kd = 10 µM）。金畔生物是AAT Bioquest 的中国代理商，为您提供最优质的钙离子荧光探针Rhod-4, 钠盐。

点击查看光谱

钙离子篇：时间轴式讲解应用于钙离子检测的探针

产品说明书

操作步骤

1.使用钙指示剂AM Esters加载细胞：

        AM酯是非极性酯，其易于穿过活细胞膜，并且通过活细胞内的细胞酯酶快速水解。 AM酯广泛用于非侵入性地将各种极性荧光探针装载到活细胞中。 但是，使用AM酯时必须小心，因为它们易于水解，特别是在溶液中。 它们应在使用前用高质量的无水二甲基亚砜（DMSO）重新配制。 DMSO储备溶液应在-20°C下干燥储存并避光。 在这些条件下，AM酯应稳定数月。

        以下是我们推荐的将AM酯加载到活细胞中的方案。该方案仅提供指南，实际情况应根据您的具体需求进行修改。

a）在高质量无水DMSO中制备2至5 mM AM酯原液。

b）在实验当天，将钙指示剂溶解在DMSO中或将等份的指示剂储备溶液解冻至室温。使用0.02％Pluronic®F-127在您选择的缓冲液（如Hanks和Hepes缓冲液）中制备1至10μM的工作溶液。对于大多数细胞系，我们建议钙指示剂的最终浓度为4-5 uM。 细胞加载所需指标的确切浓度必须根据经验确定。 为避免因过载和潜在染料毒性引起的任何伪影，建议使用可产生足够信号强度的最小探针浓度。

注意：非离子洗涤剂Pluronic®F-127有时用于增加钙指示剂AM酯的水溶性。

c）如果您的细胞含有有机阴离子转运蛋白，可以在细胞培养基中加入丙磺舒（1-2.5 mM）或磺吡酮（0.1-0.25 mM），以减少脱酯化指标的泄漏。 在室温或37°C下用钙指示剂酯孵育细胞20分钟至1小时。

d）在HHBS或您选择的缓冲液（含有阴离子转运蛋白抑制剂，如2.5mM丙磺舒，如果适用）中洗涤细胞1-2次以除去过量的探针。

e）在所需的Ex / Em波长下进行实验（见说明书中的表1）。

2.测量细胞内钙响应：

        为了确定溶液的游离钙浓度或单波长钙指示剂的Kd，使用以下等式：[Ca]_free = K_d[F – F_min]/F_max – F]

        其中F是实验钙水平下指示剂的荧光，Fmin是不存在钙时的荧光，Fmax是钙饱和探针的荧光。 解离常数（Kd）是探针对钙的亲和力的量度。 与校准溶液相比，荧光指示剂的Ca2 +结合和光谱性质在细胞环境中变化非常显着。 细胞内指标的原位校准通常产生显着高于体外测定的Kd值。 通过在离子载体如A-23187,4-溴A-23187和离子霉素存在下将加载的细胞暴露于受控的Ca 2+缓冲液来进行原位校准。 或者，细胞透化剂如洋地黄皂苷或X-100可用于将指示剂暴露于细胞外培养基的受控Ca2 +水平。 说明书中的表1列出了一些钙试剂的Kd值供您参考。

参考文献

Effect of stem cell niche elasticity/ECM protein on the self-beating cardiomyocyte differentiation of inducedpluripotent stem (iPS) cells at different stages
Authors: Mitsuhi Hirata, Tetsuji Yamaoka
Journal: Acta Biomaterialia (2017)

Emerin plays a crucial role in nuclear invagination and in the nuclear calcium transient
Authors: Masaya Shimojima, Shinsuke Yuasa, Chikaaki Motoda, Gakuto Yozu, Toshihiro Nagai, Shogo Ito, Mark Lachmann, Shin Kashimura, Makoto Takei, Dai Kusumoto
Journal: Scientific Reports (2017)

Preliminary findings on ultrasound modulation of the electromechanical function of human stem-cell-derived cardiomyocytes
Authors: Andrew William Chen, Aleksandra Klimas, Vesna Zderic, Ivan Suares Castellanos, Emilia Entcheva
Journal: (2017): 1–4

The role of spatial organization of Ca (2+) release sites in the generation of arrhythmogenic diastolic Ca (2+) release in myocytes from failing hearts.
Authors: Andriy E Belevych, Hsiang-Ting Ho, Ingrid M Bonilla, Radmila Terentyeva, Karsten E Schober, Dmitry Terentyev, Cynthia A Carnes, Sándor Györke
Journal: Basic research in cardiology (2017): 44

Dynamic polyrotaxane-coated surface for effective differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into cardiomyocytes
Authors: Ji-Hun Seo, Mitsuhi Hirata, Sachiro Kakinoki, Tetsuji Yamaoka, Nobuhiko Yui
Journal: RSC Advances (2016): 35668–35676

Individual evaluation of cardiac marker expression and self-beating during cardiac differentiation of P19CL6 cells on different culture substrates
Authors: Tetsuji Yamaoka, Mitsuhi Hirata, Takaaki Dan, Atsushi Yamashita, Akihisa Otaka, Takahiko Nakaoki, Azizi Miskon, Sachiro Kakinoki, Atsushi Mahara
Journal: Journal of Biomedical Materials Research Part A (2016)

Involvement of aberrant calcium signalling in herpetic neuralgia
Authors: Rebekah A Warwick, Menachem Hanani
Journal: Experimental neurology (2016): 10–18

Multiple pathways for elevating extracellular adenosine in the rat hippocampal CA1 region characterized by adenosine sensor cells
Authors: Kunihiko Yamashiro, Yuki Fujii, Shohei Maekawa, Mitsuhiro Morita
Journal: Journal of Neurochemistry (2016)

OptoDyCE as an automated system for high-throughput all-optical dynamic cardiac electrophysiology
Authors: Aleksandra Klimas, Christina M Ambrosi, Jinzhu Yu, John C Williams, Harold Bien, Emilia Entcheva
Journal: Nature communications (2016)

The G protein-coupled receptor GPR157 regulates neuronal differentiation of radial glial progenitors through the Gq-IP3 pathway
Authors: Yutaka Takeo, Nobuhiro Kurabayashi, Minh Dang Nguyen, Kamon Sanada
Journal: Scientific reports (2016)

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钙离子荧光探针Rhod-4, 钾盐

	货号	21119	存储条件	在零下15度以下保存, 避免光照
	规格	1 mg	价格	6432
	Ex (nm)	523	Em (nm)	551
	分子量	880.07	溶剂	Water
	产品详细介绍

简要概述

钙离子荧光探针Rhod-4, 钾盐是美国AAT Bioquest生产的用于钙通量测定的试剂，钙测量对于许多生物学研究至关重要。在结合Ca2+后显示光谱响应的荧光探针使研究人员能够使用荧光显微镜，流式细胞仪，荧光光谱和荧光酶标仪来研究细胞内游离Ca2+浓度的变化。在可见光激发钙指示剂中，Fluo-3和Fluo-4最常用。但是，Fluo-3 AM和Fluo-4 AM在酯酶水解后在活细胞中仅适度发荧光，并且需要苛刻的细胞加载条件才能最大化其细胞钙反应。开发Fluo-8®染料可改善细胞负载和钙响应，同时保持便捷的Fluo-3和Fluo-4光谱波长（在〜490 nm处具有最大激发和在〜520 nm处具有最大发射）。Fluo-8®AM仅需要室温，而Fluo-3 AM和Fluo-4 AM需要37℃的细胞负载。此外，Fluo-8®的亮度是Fluo-4 AM的2倍，是Fluo-3 AM的4倍。AAT Bioquest提供了一套出色的Fluo-8®试剂，具有不同的钙结合亲和力（Fluo-8®：Kd = 389 nM； Fluo-8H：Kd = 232 nM； Fluo-8L：Kd = 1.86 µM； Fluo-8FF ：Kd = 10 µM）。金畔生物是AAT Bioquest 的中国代理商，为您提供最优质的钙离子荧光探针Rhod-4, 钾盐。

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钙离子篇：时间轴式讲解应用于钙离子检测的探针

产品说明书

操作步骤

1.使用钙指示剂AM Esters加载细胞：

        AM酯是非极性酯，其易于穿过活细胞膜，并且通过活细胞内的细胞酯酶快速水解。 AM酯广泛用于非侵入性地将各种极性荧光探针装载到活细胞中。 但是，使用AM酯时必须小心，因为它们易于水解，特别是在溶液中。 它们应在使用前用高质量的无水二甲基亚砜（DMSO）重新配制。 DMSO储备溶液应在-20°C下干燥储存并避光。 在这些条件下，AM酯应稳定数月。

        以下是我们推荐的将AM酯加载到活细胞中的方案。该方案仅提供指南，实际情况应根据您的具体需求进行修改。

a）在高质量无水DMSO中制备2至5 mM AM酯原液。

b）在实验当天，将钙指示剂溶解在DMSO中或将等份的指示剂储备溶液解冻至室温。使用0.02％Pluronic®F-127在您选择的缓冲液（如Hanks和Hepes缓冲液）中制备1至10μM的工作溶液。对于大多数细胞系，我们建议钙指示剂的最终浓度为4-5 uM。 细胞加载所需指标的确切浓度必须根据经验确定。 为避免因过载和潜在染料毒性引起的任何伪影，建议使用可产生足够信号强度的最小探针浓度。

注意：非离子洗涤剂Pluronic®F-127有时用于增加钙指示剂AM酯的水溶性。

c）如果您的细胞含有有机阴离子转运蛋白，可以在细胞培养基中加入丙磺舒（1-2.5 mM）或磺吡酮（0.1-0.25 mM），以减少脱酯化指标的泄漏。 在室温或37°C下用钙指示剂酯孵育细胞20分钟至1小时。

d）在HHBS或您选择的缓冲液（含有阴离子转运蛋白抑制剂，如2.5mM丙磺舒，如果适用）中洗涤细胞1-2次以除去过量的探针。

e）在所需的Ex / Em波长下进行实验（见说明书中的表1）。

2.测量细胞内钙响应：

        为了确定溶液的游离钙浓度或单波长钙指示剂的Kd，使用以下等式：[Ca]_free = K_d[F – F_min]/F_max – F]

        其中F是实验钙水平下指示剂的荧光，Fmin是不存在钙时的荧光，Fmax是钙饱和探针的荧光。 解离常数（Kd）是探针对钙的亲和力的量度。 与校准溶液相比，荧光指示剂的Ca2 +结合和光谱性质在细胞环境中变化非常显着。 细胞内指标的原位校准通常产生显着高于体外测定的Kd值。 通过在离子载体如A-23187,4-溴A-23187和离子霉素存在下将加载的细胞暴露于受控的Ca 2+缓冲液来进行原位校准。 或者，细胞透化剂如洋地黄皂苷或X-100可用于将指示剂暴露于细胞外培养基的受控Ca2 +水平。 说明书中的表1列出了一些钙试剂的Kd值供您参考。

参考文献

Effect of stem cell niche elasticity/ECM protein on the self-beating cardiomyocyte differentiation of inducedpluripotent stem (iPS) cells at different stages
Authors: Mitsuhi Hirata, Tetsuji Yamaoka
Journal: Acta Biomaterialia (2017)

Emerin plays a crucial role in nuclear invagination and in the nuclear calcium transient
Authors: Masaya Shimojima, Shinsuke Yuasa, Chikaaki Motoda, Gakuto Yozu, Toshihiro Nagai, Shogo Ito, Mark Lachmann, Shin Kashimura, Makoto Takei, Dai Kusumoto
Journal: Scientific Reports (2017)

Preliminary findings on ultrasound modulation of the electromechanical function of human stem-cell-derived cardiomyocytes
Authors: Andrew William Chen, Aleksandra Klimas, Vesna Zderic, Ivan Suares Castellanos, Emilia Entcheva
Journal: (2017): 1–4

The role of spatial organization of Ca (2+) release sites in the generation of arrhythmogenic diastolic Ca (2+) release in myocytes from failing hearts.
Authors: Andriy E Belevych, Hsiang-Ting Ho, Ingrid M Bonilla, Radmila Terentyeva, Karsten E Schober, Dmitry Terentyev, Cynthia A Carnes, Sándor Györke
Journal: Basic research in cardiology (2017): 44

Dynamic polyrotaxane-coated surface for effective differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into cardiomyocytes
Authors: Ji-Hun Seo, Mitsuhi Hirata, Sachiro Kakinoki, Tetsuji Yamaoka, Nobuhiko Yui
Journal: RSC Advances (2016): 35668–35676

Individual evaluation of cardiac marker expression and self-beating during cardiac differentiation of P19CL6 cells on different culture substrates
Authors: Tetsuji Yamaoka, Mitsuhi Hirata, Takaaki Dan, Atsushi Yamashita, Akihisa Otaka, Takahiko Nakaoki, Azizi Miskon, Sachiro Kakinoki, Atsushi Mahara
Journal: Journal of Biomedical Materials Research Part A (2016)

Involvement of aberrant calcium signalling in herpetic neuralgia
Authors: Rebekah A Warwick, Menachem Hanani
Journal: Experimental neurology (2016): 10–18

Multiple pathways for elevating extracellular adenosine in the rat hippocampal CA1 region characterized by adenosine sensor cells
Authors: Kunihiko Yamashiro, Yuki Fujii, Shohei Maekawa, Mitsuhiro Morita
Journal: Journal of Neurochemistry (2016)

OptoDyCE as an automated system for high-throughput all-optical dynamic cardiac electrophysiology
Authors: Aleksandra Klimas, Christina M Ambrosi, Jinzhu Yu, John C Williams, Harold Bien, Emilia Entcheva
Journal: Nature communications (2016)

The G protein-coupled receptor GPR157 regulates neuronal differentiation of radial glial progenitors through the Gq-IP3 pathway
Authors: Yutaka Takeo, Nobuhiro Kurabayashi, Minh Dang Nguyen, Kamon Sanada
Journal: Scientific reports (2016)

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钙离子荧光探针Rhod-4, AM

	货号	21120	存储条件	在零下15度以下保存, 避免光照
	规格	1 mg	价格	6432
	Ex (nm)	523	Em (nm)	551
	分子量	1015.96	溶剂	DMSO
	产品详细介绍

简要概述

产品基本信息

货号：21120

产品名称：钙离子荧光探针Rhod-4, AM

规格：1mg

储存条件：-15℃避光防潮

保质期：24个月

产品物理化学光谱特性

分子量：1015.96

溶剂：DMSO

激发波长(nm)：524

发射波长(nm)：551

产品介绍

钙离子荧光探针Rhod-4, AM是美国AAT Bioquest生产的钙离子荧光探针，钙测量对于许多生物学研究至关重要。在结合Ca2+后显示光谱响应的荧光探针使研究人员能够使用荧光显微镜，流式细胞仪，荧光光谱和荧光酶标仪来研究细胞内游离Ca2+浓度的变化。在红色荧光钙指示剂中，Rhod-2最常用。但是，Rhod-2 AM在酯酶水解后仅在活细胞中呈中等荧光，并且细胞钙反应非常小。Rhod-4 的开发旨在改善Rhod-2细胞的负载和钙反应，同时保持Rhod-2的光谱波长。在CHO和HEK细胞中，Rhod-4 AM的细胞钙反应敏感性比Rhod-2 AM高10倍。AAT Bioquest提供Quest Rhod-4的多种包装大小，可满足您的特殊需求，例如1 mg；10×50 µg；20×50 µg；HTS包装，不收取额外包装费用。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供最优质的钙离子荧光探针Rhod-4, AM。 

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钙离子篇：时间轴式讲解应用于钙离子检测的探针

参考文献

钙离子荧光探针Rhod-4, AM

	货号	21121	存储条件	在零下15度以下保存, 避免光照
	规格	5×50 ug	价格	2544
	Ex (nm)	523	Em (nm)	551
	分子量	1015.96	溶剂	DMSO
	产品详细介绍

简要概述

钙离子荧光探针Rhod-4, AM是美国AAT Bioquest生产的用于标记钙离子的荧光探针，钙的测量对于许多生物学研究至关重要。荧光探针显示结合Ca²⁺后的光谱响应，使研究人员能够通过荧光显微镜，流式细胞仪，荧光光谱和荧光酶标仪研究细胞内游离Ca²⁺浓度的变化。Rhod-2最常用于红色荧光钙指示剂中。然而，Rhod-2 AM在酯酶水解后仅在活细胞中发生中度荧光，并且具有非常小的细胞钙响应。Rhod-4 已被开发用于改善Rhod-2细胞负载和钙响应，同时保持Rhod-2的光谱波长。在CHO和HEK细胞中，Rhod-4 AM具有比Rhod-2 AM敏感10倍的细胞钙响应。AAT Bioquest提供多种包装尺寸的Quest Rhod-4，以满足您的特殊需求，例如1毫克; 10×50μg; 20×50μg; HTS包装，无需额外包装费用。金畔生物是AAT Bioquest 的中国代理商，为您提供最优质的钙离子荧光探针。

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钙离子篇：时间轴式讲解应用于钙离子检测的探针

产品说明书

操作步骤

1.准备HHBS缓冲液，10％Pluronic®F-127溶液和25 mM Probenecid溶液。
 

2.在高质量无水DMSO中制备2 mM至5 mM Rhod-4 ，AM原液。
2.1使用量的Rhod-4 ，AM：1 mg
2.2所需浓度：2 mM
2.3在合适的容器中，将1mg Rhod-4，AM与492.15μL无水DMSO混合。
 

3.使用10μMRhod-4 ，AM 4在HHBS中制备2X工作溶液，0.08％Pluronic®F-127和2 mM丙磺舒。
3.1最终井内浓度的Rhod-4 ，AM：5μM
3.2Pluronic®F-127的最终井内浓度：0.04％
3.3最终孔内浓度的丙磺舒：1mM
3.4在合适的容器中混合16μL的Rhod-4 ，AM，25.6μL的10％Pluronic F-127和256μL的25mM丙磺舒。然后，添加HHBS或您选择的缓冲液，直到体积为3.2 mL。
注意：对于大多数细胞系，我们建议使用Rhod-4 的最终浓度，AM为4至5μM。
注意：推荐的Pluronic F-127孔浓度最终为0.02％至0.04％。
注意：推荐的最终浓度为1至2.5 mM的Probenecid。
 

4.将100μL染料工作溶液加入已经含有100μL培养基的所需孔中。
4.1该步骤将染料工作溶液从2X稀释至1X，并将每种组分的最终浓度调节至以下：5μM的Rhod-4 ，AM，0.04％Pluronic F-127,1mM丙磺舒。
 

5.孵育染料
5.1将染料加载板在细胞培养箱中孵育20-120分钟。
5.2将染料加载板在室温下孵育30分钟。
 

6.用1.0 mM Probenecid准备HHBS缓冲液（或您选择的缓冲液）。
6.1在合适的容器中加入160μL的25mM丙磺舒。接下来，添加HHBS或您选择的缓冲液，直到体积为4 mL。
 

7.用HHBS缓冲液或您选择的缓冲液替换染料工作溶液，使用1.0 mM Probenecid。
7.1首先，从所需孔中除去200μL染料工作溶液和培养基。
7.2在相同的孔中加入200μL含有1.0mM丙磺舒的HHBS（或您选择的缓冲液）。
 

8.运行实验
8.1为您的样品添加所需的处理。
8.2以Ex / Em = 524/551 nm运行实验。

参考文献

Central role of IP 3 R2-mediated Ca 2+ oscillation in self-renewal of liver cancer stem cells elucidated by high-signal ER sensor
Authors: Cuiwei Sun, Bo Shui, Wei Zhao, Hui Liu, Wenwen Li, Jane C Lee, Robert Doran, Frank K Lee, Tao Sun, Qing Sunny Shen
Journal: Cell death & disease (2019): 396

Imaging elemental events of store-operated Ca2+ entry in invading cancer cells with plasmalemmal targeted sensors
Authors: Fujian Lu, Jianwei Sun, Qiaoxia Zheng, Jinghang Li, Yuanzhao Hu, Peng Yu, Huifang He, Yan Zhao, Xianhua Wang, Shengyu Yang
Journal: J Cell Sci (2019): jcs–224923

Autocrine GABA signaling distinctively regulates phenotypic activation of mouse pulmonary macrophages
Authors: Luan Januzi, Jacob W Poirier, Matthew JE Maksoud, Yun-Yan Xiang, Rudolf AW Veldhuizen, Sean E Gill, Sean P Cregan, Haibo Zhang, Gregory A Dekaban, Wei-Yang Lu
Journal: Cellular Immunology (2018)

Three-dimensional model of intracellular and intercellular Ca2+ waves propagation in endothelial cells
Authors: Toshihiro Sera, Shingo Komine, Masataka Arai, Yasuhiro Sunaga, Hideo Yokota, Susumu Kudo
Journal: Biochemical and Biophysical Research Communications (2018)

Effect of stem cell niche elasticity/ECM protein on the self-beating cardiomyocyte differentiation of inducedpluripotent stem (iPS) cells at different stages
Authors: Mitsuhi Hirata, Tetsuji Yamaoka
Journal: Acta Biomaterialia (2017)

Emerin plays a crucial role in nuclear invagination and in the nuclear calcium transient
Authors: Masaya Shimojima, Shinsuke Yuasa, Chikaaki Motoda, Gakuto Yozu, Toshihiro Nagai, Shogo Ito, Mark Lachmann, Shin Kashimura, Makoto Takei, Dai Kusumoto
Journal: Scientific Reports (2017)

Preliminary findings on ultrasound modulation of the electromechanical function of human stem-cell-derived cardiomyocytes
Authors: Andrew William Chen, Aleksandra Klimas, Vesna Zderic, Ivan Suares Castellanos, Emilia Entcheva
Journal: (2017): 1–4

The role of spatial organization of Ca (2+) release sites in the generation of arrhythmogenic diastolic Ca (2+) release in myocytes from failing hearts.
Authors: Andriy E Belevych, Hsiang-Ting Ho, Ingrid M Bonilla, Radmila Terentyeva, Karsten E Schober, Dmitry Terentyev, Cynthia A Carnes, Sándor Györke
Journal: Basic research in cardiology (2017): 44

Dynamic polyrotaxane-coated surface for effective differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into cardiomyocytes
Authors: Ji-Hun Seo, Mitsuhi Hirata, Sachiro Kakinoki, Tetsuji Yamaoka, Nobuhiko Yui
Journal: RSC Advances (2016): 35668–35676

Individual evaluation of cardiac marker expression and self-beating during cardiac differentiation of P19CL6 cells on different culture substrates
Authors: Tetsuji Yamaoka, Mitsuhi Hirata, Takaaki Dan, Atsushi Yamashita, Akihisa Otaka, Takahiko Nakaoki, Azizi Miskon, Sachiro Kakinoki, Atsushi Mahara
Journal: Journal of Biomedical Materials Research Part A (2016)

钙离子荧光探针Rhod-4, AM

	货号	21122	存储条件	在零下15度以下保存, 避免光照
	规格	10×50 ug	价格	3840
	Ex (nm)	523	Em (nm)	551
	分子量	1015.96	溶剂	DMSO
	产品详细介绍

简要概述

产品基本信息

货号：21122

产品名称：钙离子荧光探针Rhod-4, AM

规格：10x50ug

储存条件：-15℃避光防潮

保质期：24个月

产品物理化学光谱特性

分子量：1015.96

溶剂：DMSO

激发波长(nm)：494

发射波长(nm)：517

产品介绍

钙离子荧光探针Rhod-4, AM是美国AAT Bioquest生产的用于标记钙离子的荧光探针，钙的测量对于许多生物学研究至关重要。荧光探针显示结合Ca²⁺后的光谱响应，使研究人员能够通过荧光显微镜，流式细胞仪，荧光光谱和荧光酶标仪研究细胞内游离Ca²⁺浓度的变化。Rhod-2最常用于红色荧光钙指示剂中。然而，Rhod-2 AM在酯酶水解后仅在活细胞中发生中度荧光，并且具有非常小的细胞钙响应。Rhod-4 已被开发用于改善Rhod-2细胞负载和钙响应，同时保持Rhod-2的光谱波长。在CHO和HEK细胞中，Rhod-4 AM具有比Rhod-2 AM敏感10倍的细胞钙响应。AAT Bioquest提供多种包装尺寸的Quest Rhod-4，以满足您的特殊需求，例如1毫克; 10×50μg; 20×50μg; HTS包装，无需额外包装费用。金畔生物是AAT Bioquest 的中国代理商，为您提供最优质的钙离子荧光探针。

点击查看光谱

点击查看实验方案

钙离子篇：时间轴式讲解应用于钙离子检测的探针

参考文献

钙离子荧光探针Rhod-4, 钠盐

	货号	21128	存储条件	在零下15度以下保存, 避免光照
	规格	5×50 ug	价格	3840
	Ex (nm)	523	Em (nm)	551
	分子量	815.64	溶剂	Water
	产品详细介绍

简要概述

钙离子荧光探针Rhod-4, 钠盐是美国AAT Bioquest生产的钙离子指示剂，钙测量对于许多生物学研究至关重要。在结合Ca2+后显示光谱响应的荧光探针使研究人员能够使用荧光显微镜，流式细胞仪，荧光光谱和荧光酶标仪来研究细胞内游离Ca2+浓度的变化。在红色荧光钙指示剂中，Rhod-2最常用。但是，Rhod-2 AM在酯酶水解后仅在活细胞中呈中等荧光，并且细胞钙反应非常小。Rhod-4 的开发旨在改善Rhod-2细胞的负载和钙反应，同时保持Rhod-2的光谱波长。在CHO和HEK细胞中，Rhod-4 AM的细胞钙反应敏感性比Rhod-2 AM高10倍。AAT Bioquest提供Quest Rhod-4的多种包装大小，可满足您的特殊需求，例如1 mg；10×50 µg；20×50 µg；HTS包装，不收取额外包装费用。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供最优质的钙离子荧光探针Rhod-4, 钠盐。 

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钙离子篇：时间轴式讲解应用于钙离子检测的探针

产品说明书

钙指示剂AM Esters的使用

1.带有钙指示剂AM酯：

      AM酯是非极性酯，很容易穿过活细胞膜，并被活细胞内的细胞酯酶迅速水解。AM酯被广泛用于无创地将各种极性荧光探针装载到活细胞中。但是，使用AM酯时必须特别注意，因为它们易于水解，特别是在溶液中。它们应该用高质量的无水二甲基亚砜（DMSO）进行重构。DMSO储备溶液应在-20°C的干燥环境中保存，并避光。在这些条件下，AM酯应稳定数月。

以下是我们推荐的将AM酯加载到活细胞中的方案。该协议仅提供指南，应根据您的特定需求进行修改。

a）在高质量无水DMSO中制备2至5 mM AM酯储备溶液。

b）在实验当天，将固体的钙指示剂溶解在DMSO中，或将等分的指示剂储备溶液解冻至室温。在您选择的含0.04％Pluronic®F-127的缓冲液（例如Hanks and Hepes缓冲液）中，准备2至20 µM的工作溶液。对于大多数细胞系，我们建议钙指示剂的终浓度为4-5 uM。必须根据经验确定细胞加载所需指示剂的确切浓度。为避免因过载和潜在的染料毒性而导致的任何伪影，建议使用可以产生足够信号强度的最小探针浓度。

c）如果您的细胞（例如CHO细胞）中含有有机阴离子转运蛋白，则可以将丙磺舒（2–5 mM）或亚砜吡嗪（0.2–0.5 mM）添加到染料工作溶液中（最终孔浓度为1）丙磺舒为-2.5 mM，亚磺酰吡嗪为0.1 -0.25 mM，以减少去酯化指示剂的泄漏。

d）将等体积的染料工作溶液（来自步骤b或c）添加到细胞板中。

e）在温度或37°C下将染料加载板室孵育20分钟（尤其是Fluo-8 AM）至2小时，然后在室温下将板孵育30分钟。

注1：降低加载温度可能会减少指示器的分隔。

注2：将Cal-520 AM孵育2小时以上，对于某些细胞系会产生更好的信号强度。

f） 用HHBS或您选择的缓冲液（包含阴离子转运蛋白抑制剂，如1 mM丙磺舒，如果适用）替换染料工作溶液，以除去过量的探针。

g）在所需的Ex / Em波长下运行实验。

2.测量细胞内钙响应：

为了确定溶液的游离钙浓度或单波长钙指示剂的Kd，使用以下等式：

[Ca]free = Kd[F ─ Fmin]/Fmax ─ F]

其中F是实验钙水平下指示剂的荧光，Fmin是不存在钙时的荧光，Fmax是钙饱和探针的荧光。

        解离常数（Kd）是探针对钙的亲和力的量度。 与校准溶液相比，荧光指示剂的Ca结合和光谱性质在细胞环境中变化非常显着。 细胞内指标的原位反应校准通常产生显着高于体外测定的Kd值。 通过在离子载体如A-23187,4-溴A-23187和离子霉素存在下将加载的细胞暴露于受控的Ca²⁺缓冲液来进行原位校准。 或者，细胞透化剂如洋地黄皂苷或X-100可用于将指示剂暴露于细胞外培养基的受控Ca²⁺水平。

参考文献

Effect of stem cell niche elasticity/ECM protein on the self-beating cardiomyocyte differentiation of inducedpluripotent stem (iPS) cells at different stages
Authors: Mitsuhi Hirata, Tetsuji Yamaoka
Journal: Acta Biomaterialia (2017)

Emerin plays a crucial role in nuclear invagination and in the nuclear calcium transient
Authors: Masaya Shimojima, Shinsuke Yuasa, Chikaaki Motoda, Gakuto Yozu, Toshihiro Nagai, Shogo Ito, Mark Lachmann, Shin Kashimura, Makoto Takei, Dai Kusumoto
Journal: Scientific Reports (2017)

Preliminary findings on ultrasound modulation of the electromechanical function of human stem-cell-derived cardiomyocytes
Authors: Andrew William Chen, Aleksandra Klimas, Vesna Zderic, Ivan Suares Castellanos, Emilia Entcheva
Journal: (2017): 1–4

The role of spatial organization of Ca (2+) release sites in the generation of arrhythmogenic diastolic Ca (2+) release in myocytes from failing hearts.
Authors: Andriy E Belevych, Hsiang-Ting Ho, Ingrid M Bonilla, Radmila Terentyeva, Karsten E Schober, Dmitry Terentyev, Cynthia A Carnes, Sándor Györke
Journal: Basic research in cardiology (2017): 44

Dynamic polyrotaxane-coated surface for effective differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into cardiomyocytes
Authors: Ji-Hun Seo, Mitsuhi Hirata, Sachiro Kakinoki, Tetsuji Yamaoka, Nobuhiko Yui
Journal: RSC Advances (2016): 35668–35676

Individual evaluation of cardiac marker expression and self-beating during cardiac differentiation of P19CL6 cells on different culture substrates
Authors: Tetsuji Yamaoka, Mitsuhi Hirata, Takaaki Dan, Atsushi Yamashita, Akihisa Otaka, Takahiko Nakaoki, Azizi Miskon, Sachiro Kakinoki, Atsushi Mahara
Journal: Journal of Biomedical Materials Research Part A (2016)

Involvement of aberrant calcium signalling in herpetic neuralgia
Authors: Rebekah A Warwick, Menachem Hanani
Journal: Experimental neurology (2016): 10–18

Multiple pathways for elevating extracellular adenosine in the rat hippocampal CA1 region characterized by adenosine sensor cells
Authors: Kunihiko Yamashiro, Yuki Fujii, Shohei Maekawa, Mitsuhiro Morita
Journal: Journal of Neurochemistry (2016)

OptoDyCE as an automated system for high-throughput all-optical dynamic cardiac electrophysiology
Authors: Aleksandra Klimas, Christina M Ambrosi, Jinzhu Yu, John C Williams, Harold Bien, Emilia Entcheva
Journal: Nature communications (2016)

The G protein-coupled receptor GPR157 regulates neuronal differentiation of radial glial progenitors through the Gq-IP3 pathway
Authors: Yutaka Takeo, Nobuhiro Kurabayashi, Minh Dang Nguyen, Kamon Sanada
Journal: Scientific reports (2016)

相关产品

钙离子荧光探针Rhod-4, 钾盐

	货号	21129	存储条件	在零下15度以下保存, 避免光照
	规格	5×50 ug	价格	3840
	Ex (nm)	523	Em (nm)	551
	分子量	880.07	溶剂	Water
	产品详细介绍

简要概述

钙离子荧光探针Rhod-4, 钾盐是美国AAT Bioquest生产的钙离子指示剂，钙测量对于许多生物学研究至关重要。在结合Ca2 +后显示光谱响应的荧光探针使研究人员能够使用荧光显微镜，流式细胞仪，荧光光谱和荧光酶标仪来研究细胞内游离Ca2 +浓度的变化。在红色荧光钙指示剂中，Rhod-2最常用。但是，Rhod-2 AM在酯酶水解后仅在活细胞中呈中等荧光，并且细胞钙反应非常小。Rhod-4 的开发旨在改善Rhod-2细胞的负载和钙反应，同时保持Rhod-2的光谱波长。在CHO和HEK细胞中，Rhod-4 AM的细胞钙反应敏感性比Rhod-2 AM高10倍。AAT Bioquest提供Quest Rhod-4的多种包装大小，可满足您的特殊需求，例如1 mg；10×50 µg；20×50 µg；HTS包装，不收取额外包装费用。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供最优质的钙离子荧光探针Rhod-4, 钾盐。 

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钙离子篇：时间轴式讲解应用于钙离子检测的探针

产品说明书

钙指示剂AM Esters的使用

1.带有钙指示剂AM酯：

      AM酯是非极性酯，很容易穿过活细胞膜，并被活细胞内的细胞酯酶迅速水解。AM酯被广泛用于无创地将各种极性荧光探针装载到活细胞中。但是，使用AM酯时必须特别注意，因为它们易于水解，特别是在溶液中。它们应该用高质量的无水二甲基亚砜（DMSO）进行重构。DMSO储备溶液应在-20°C的干燥环境中保存，并避光。在这些条件下，AM酯应稳定数月。

以下是我们推荐的将AM酯加载到活细胞中的方案。该协议仅提供指南，应根据您的特定需求进行修改。

a）在高质量无水DMSO中制备2至5 mM AM酯储备溶液。

b）在实验当天，将固体的钙指示剂溶解在DMSO中，或将等分的指示剂储备溶液解冻至室温。在您选择的含0.04％Pluronic®F-127的缓冲液（例如Hanks and Hepes缓冲液）中，准备2至20 µM的工作溶液。对于大多数细胞系，我们建议钙指示剂的终浓度为4-5 uM。必须根据经验确定细胞加载所需指示剂的确切浓度。为避免因过载和潜在的染料毒性而导致的任何伪影，建议使用可以产生足够信号强度的最小探针浓度。

c）如果您的细胞（例如CHO细胞）中含有有机阴离子转运蛋白，则可以将丙磺舒（2–5 mM）或亚砜吡嗪（0.2–0.5 mM）添加到染料工作溶液中（最终孔浓度为1）丙磺舒为-2.5 mM，亚磺酰吡嗪为0.1 -0.25 mM，以减少去酯化指示剂的泄漏。

d）将等体积的染料工作溶液（来自步骤b或c）添加到细胞板中。

e）在温度或37°C下将染料加载板室孵育20分钟（尤其是Fluo-8 AM）至2小时，然后在室温下将板孵育30分钟。

注1：降低加载温度可能会减少指示器的分隔。

注2：将Cal-520 AM孵育2小时以上，对于某些细胞系会产生更好的信号强度。

f） 用HHBS或您选择的缓冲液（包含阴离子转运蛋白抑制剂，如1 mM丙磺舒，如果适用）替换染料工作溶液，以除去过量的探针。

g）在所需的Ex / Em波长下运行实验。

2.测量细胞内钙响应：

为了确定溶液的游离钙浓度或单波长钙指示剂的Kd，使用以下等式：

[Ca]free = Kd[F ─ Fmin]/Fmax ─ F]

其中F是实验钙水平下指示剂的荧光，Fmin是不存在钙时的荧光，Fmax是钙饱和探针的荧光。

        解离常数（Kd）是探针对钙的亲和力的量度。 与校准溶液相比，荧光指示剂的Ca结合和光谱性质在细胞环境中变化非常显着。 细胞内指标的原位反应校准通常产生显着高于体外测定的Kd值。 通过在离子载体如A-23187,4-溴A-23187和离子霉素存在下将加载的细胞暴露于受控的Ca²⁺缓冲液来进行原位校准。 或者，细胞透化剂如洋地黄皂苷或X-100可用于将指示剂暴露于细胞外培养基的受控Ca²⁺水平。

参考文献

Effect of stem cell niche elasticity/ECM protein on the self-beating cardiomyocyte differentiation of inducedpluripotent stem (iPS) cells at different stages
Authors: Mitsuhi Hirata, Tetsuji Yamaoka
Journal: Acta Biomaterialia (2017)

Emerin plays a crucial role in nuclear invagination and in the nuclear calcium transient
Authors: Masaya Shimojima, Shinsuke Yuasa, Chikaaki Motoda, Gakuto Yozu, Toshihiro Nagai, Shogo Ito, Mark Lachmann, Shin Kashimura, Makoto Takei, Dai Kusumoto
Journal: Scientific Reports (2017)

Preliminary findings on ultrasound modulation of the electromechanical function of human stem-cell-derived cardiomyocytes
Authors: Andrew William Chen, Aleksandra Klimas, Vesna Zderic, Ivan Suares Castellanos, Emilia Entcheva
Journal: (2017): 1–4

The role of spatial organization of Ca (2+) release sites in the generation of arrhythmogenic diastolic Ca (2+) release in myocytes from failing hearts.
Authors: Andriy E Belevych, Hsiang-Ting Ho, Ingrid M Bonilla, Radmila Terentyeva, Karsten E Schober, Dmitry Terentyev, Cynthia A Carnes, Sándor Györke
Journal: Basic research in cardiology (2017): 44

Dynamic polyrotaxane-coated surface for effective differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into cardiomyocytes
Authors: Ji-Hun Seo, Mitsuhi Hirata, Sachiro Kakinoki, Tetsuji Yamaoka, Nobuhiko Yui
Journal: RSC Advances (2016): 35668–35676

Individual evaluation of cardiac marker expression and self-beating during cardiac differentiation of P19CL6 cells on different culture substrates
Authors: Tetsuji Yamaoka, Mitsuhi Hirata, Takaaki Dan, Atsushi Yamashita, Akihisa Otaka, Takahiko Nakaoki, Azizi Miskon, Sachiro Kakinoki, Atsushi Mahara
Journal: Journal of Biomedical Materials Research Part A (2016)

Involvement of aberrant calcium signalling in herpetic neuralgia
Authors: Rebekah A Warwick, Menachem Hanani
Journal: Experimental neurology (2016): 10–18

Multiple pathways for elevating extracellular adenosine in the rat hippocampal CA1 region characterized by adenosine sensor cells
Authors: Kunihiko Yamashiro, Yuki Fujii, Shohei Maekawa, Mitsuhiro Morita
Journal: Journal of Neurochemistry (2016)

OptoDyCE as an automated system for high-throughput all-optical dynamic cardiac electrophysiology
Authors: Aleksandra Klimas, Christina M Ambrosi, Jinzhu Yu, John C Williams, Harold Bien, Emilia Entcheva
Journal: Nature communications (2016)

The G protein-coupled receptor GPR157 regulates neuronal differentiation of radial glial progenitors through the Gq-IP3 pathway
Authors: Yutaka Takeo, Nobuhiro Kurabayashi, Minh Dang Nguyen, Kamon Sanada
Journal: Scientific reports (2016)

相关产品

钙离子荧光探针Cal-520, 钾盐

	货号	21140	存储条件	在零下15度以下保存, 避免光照
	规格	10×50 ug	价格	3840
	Ex (nm)	493	Em (nm)	515
	分子量	921.08	溶剂	Water
	产品详细介绍

简要概述

Cal-520 ，Cal-590 和Cal-630 提供最强大的均匀荧光测定工具，用于检测细胞内钙动员。它们是荧光钙敏感染料，与现有的钙指示剂（如Fluo-3 AM，Fluo-4 AM和Rhod-2 AM）相比，具有显着改善的信噪比和细胞内保留。表达通过钙发出信号的GPCR或钙通道的细胞可以预装载可以穿过细胞膜的Cal-520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM。一旦进入细胞内，Cal 520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM的亲脂性阻断基团被细胞内酯酶切割，产生带负电荷的荧光染料，留在细胞内。它们与钙结合后的荧光大大增强。当用激动剂刺激细胞时，该受体表示细胞内钙的释放，这显着增加了Cal-520 ，Cal-590 或Cal-630 的荧光。高灵敏度和> 100倍荧光增强的特性使Cal-520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM成为测量细胞钙的理想指标。高信噪比和更好的细胞内保留使Cal-520 ，Cal-590 或Cal-630 钙测定成为评估GPCR和钙通道靶标以及筛选其激动剂和拮抗剂的有力工具。

除了方便的激发波长和钙的大荧光增强外，Cal-520 ，Cal-590 和Cal-630 主要定位于细胞溶胶中，不像Rhod-2主要位于线粒体中。 此外，Cal-590 和Cal-630 的长Ex / Em波长使这些染料成为完美的钙指示剂，与绿色荧光蛋白（GFP）细胞系的多色检测兼容。 此外，Cal-520 ，Cal-590 或Cal-630 钙测定经过优化，可与大多数现有荧光仪器兼容。 Cal-520在488 nm处可以很好地激发，并与FITC滤光片组一起使用。 Cal-590经过优化，可在555 nm激发，并与TRITC / Cy3滤光片组配合使用。 Cal-590经过优化，可在594 nm激发，并与TexasRed®滤光片组配合使用。光谱和钙结合特性总结如下（参见说明书中的表1）。

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钙离子篇：时间轴式讲解应用于钙离子检测的探针

产品说明书

使用Cal-520 AM，Cal-570 AM或Cal-630 AM酯类

1.使用Cal-520 ，Cal-590 或Cal-630 AM酯：

        AM酯是非极性酯，其易于穿过活细胞膜，并且通过活细胞内的细胞酯酶快速水解。AM酯广泛用于非侵入性地将各种极性荧光探针装载到活细胞中。但是，使用AM酯时必须小心，因为它们易于水解，特别是在溶液中。它们应在使用前重新配制成高质量的无水二甲基亚砜（DMSO）。DMSO储备溶液可以在-20℃下干燥储存并避光。在这些条件下，AM酯应稳定数月。以下是我们推荐的将Cal-520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM酯加入活细胞的方案。该方案仅提供指南，实际应根据您的具体需求进行修改。

a）在高质量无水DMSO中制备2至5 mM Cal-520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM酯的储备溶液。

b）在实验当天，将Cal-520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM溶解在DMSO中或将等份的指示剂储备溶液解冻至室温。在Hanks和Hepes缓冲液（HHBS）或您选择的缓冲液（0.04％Pluronic®F-127）中制备10至20μM的染料工作溶液。细胞加载所需指示剂的确切浓度必须凭经验确定。

注意：非离子型洗涤剂Pluronic®F-127有时用于增加Cal-520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM酯的水溶性。

c）如果您的细胞（如CHO细胞）含有有机阴离子转运蛋白，可将丙磺舒（1-2 mM）加入染料工作溶液中（最终浓度为0.5-1 mM）以减少渗漏去酯化指标。

d）将等体积的染料工作溶液（来自步骤b或c）加入细胞板中。

e）将染料加载板在细胞培养箱中孵育60至90分钟，然后在室温下将板孵育另外30分钟。

注意：孵育染料超过2小时可以为某些细胞系提供更好的信号强度。

f）用HHBS或您选择的缓冲液（含有阴离子转运蛋白抑制剂，如1mM丙磺舒，如果适用）替换染料工作溶液，以去除多余的探针。

g）在Ex / Em = 490 / 525nm（对于Cal-520 AM），540 / 5000nm（对于Cal-590 AM）或600 / 640nm（对于Cal-630 AM）进行实验。

2.测量细胞内钙响应：

为了确定溶液的游离钙浓度或单波长钙指示剂的Kd，使用以下等式：

[Ca]free = Kd[F ─ Fmin]/Fmax ─ F]

其中F是实验钙水平下指示剂的荧光，Fmin是不存在钙时的荧光，Fmax是钙饱和探针的荧光。

        解离常数（Kd）是探针对钙的亲和力的量度。 与校准溶液相比，荧光指示剂的Ca结合和光谱性质在细胞环境中变化非常显着。 细胞内指标的原位反应校准通常产生显着高于体外测定的Kd值。 通过在离子载体如A-23187,4-溴A-23187和离子霉素存在下将加载的细胞暴露于受控的Ca²⁺缓冲液来进行原位校准。 或者，细胞透化剂如洋地黄皂苷或X-100可用于将指示剂暴露于细胞外培养基的受控Ca²⁺水平。

参考文献

Spatio-temporal modulation of light for stimulation and recording of neuronal activity
Authors: He Ma, Michael Lawrence Castanares, Vincent Daria
Journal: (2018): 1072306

A Critical Period for the Rapid Modification of Synaptic Properties at the VPm Relay Synapse
Authors: Libiao Pan, Junhua Yang, Qian Yang, Xiaomeng Wang, Liya Zhu, Yali Liu, Huifang Lou, Chou Xu, Ying Shen, Hao Wang
Journal: Frontiers in molecular neuroscience (2017)

Advances in Two-Photon Scanning and Scanless Microscopy Technologies for Functional Neural Circuit Imaging
Authors: Simon R Schultz, Caroline S Copeland, Amanda J Foust, Peter Quicke, Renaud Schuck
Journal: Proceedings of the IEEE (2017): 139–157

Bidirectional communication between sensory neurons and osteoblasts in an in vitro co-culture system
Authors: Daisuke Kodama, Takao Hirai, Hisataka Kondo, Kazunori Hamamura, Akifumi Togari
Journal: FEBS Letters (2017)

Ca 2+ signals initiate at immobile IP 3 receptors adjacent to ER-plasma membrane junctions
Authors: Nagendra Babu Thillaiappan, Alap P Chavda, Stephen C Tovey, David L Prole, Colin W Taylor
Journal: Nature Communications (2017): 1505

Calcium Imaging Across Large Areas of Intact Vascular Endothelium Reveals Stimulus-Specific Sensory Cells
Authors: Matthew D Lee, Calum Wilson, John G McCarron
Journal: The FASEB Journal (2017): 1005–8

Calcium transient assays for compound screening with human iPSC-derived cardiomyocytes: Evaluating new tools
Authors: Neil J Daily, Radleigh Santos, Joseph Vecchi, Pinar Kemanli, Tetsuro Wakatsuki
Journal: Journal of evolving stem cell research (2017): 1

Characterization of postsynaptic calcium signals in the pyramidal neurons of anterior cingulate cortex
Authors: Xu-Hui Li, Qian Song, Tao Chen, Min Zhuo
Journal: Molecular Pain (2017): 1744806917719847

Direct measurement of TRPV4 and PIEZO1 activity reveals multiple mechanotransduction pathways in chondrocytes
Authors: M Rocio Servin-Vences, Mirko Moroni, Gary R Lewin, Kate Poole
Journal: eLife (2017): e21074

Expression of the GluA2 subunit of glutamate receptors is required for the normal dendritic differentiation of cerebellar Purkinje cells
Authors: Masahiko Tanaka, Tomomi Senda, Naohide Hirashima
Journal: Neuroscience Letters (2017)

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